m規(guī)格的精濾裝置，進一步除去大分子物質(zhì)。精濾液調(diào)節(jié)PH值6.5，過300 Da納濾膜，除去一些小分子及鹽類，再過反滲透膜濃縮，得到濃縮液。
[0025](2)濃縮液調(diào)節(jié)pH值5.5，溫度8°C，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至50%，靜置5 h，離心或過濾，收集沉淀。
[0026](3)沉淀用水溶解后過G50葡聚糖凝膠柱，用水洗脫，分別收集洗脫液前50 mL,50 - 100 mL，100 - 200 mL，濃縮后凍干。粉末用水溶解過QuikS印-100中壓柱層析柱系統(tǒng)，中壓柱自裝，中壓洗脫條件:流速20 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進樣量:5 mL ;流動相:A栗超純水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA), B栗初始濃度為10% ；洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度:0.01 min~35 min, 10%~20% ；35.01 min~125 min,20-27% ； 125.01 min~140 min,27%~90% ； 140.01 min~155 min，90%~90%，155.01 min~165min,90^10%o重復(fù)進樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰，收集洗脫峰后真空濃縮除去有機溶劑，冷凍干燥，得到初步純化的酪蛋白磷酸肽。粉末用水溶解，調(diào)節(jié)PH至5.5，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至60%，離心取沉淀。
[0027](4)反相硅膠純化。沉淀溶解再進行反相硅膠純化，HPLC系統(tǒng):LC_8A島津制備高效液相色譜儀；色譜柱:服一 0121 ;色譜條件:流速10 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進樣量:I mL ;流動相:A栗超純水(含0.1% (v/v)TFA)，B栗乙腈(含0.1% (v/v)TFA)，B栗初始濃度為5% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度:0.01 min?25 min，5%~18% ；25.01 min?85 min,18?30% ;85.01 min?95 min，309ir^70% ;95.01 min?120 min，70%~70%，120.01 min?150 min，70°/『5%。重復(fù)進樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。收集洗脫峰后真空濃縮除去有機溶劑，冷凍干燥，得到純化的酪蛋白磷酸肽。
[0028](5)再次反相硅膠純化。HPLC系統(tǒng):LC_15C島津高效液相色譜儀；色譜柱:C18，Ultimate? AQ_C18，5 μ m，4.6 X 250 mm;色譜條件:流速:1 mL/min ;檢測波長:215 nm ；進樣量:20 μ L ;流動相:Α栗超純水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA),B栗初始濃度為10% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度0~15 min, 10%~20% ； 15-50 min,20%~27% ；50.01 min?60 min,90% ；60.01 min?70 min，10%。重復(fù)進樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰后真空濃縮，除去有機溶劑，冷凍干燥，得到酪蛋白磷酸肽單體。
[0029]實施例3:—種高純度酪蛋白磷酸肽的制備，包括以下步驟:
(I)向燒杯中加純水600 mL，開攪拌200 rpm，向燒杯中緩慢投入酪蛋白100 g，在50°C條件下攪拌溶解。加入胰蛋白酶進行酶解，酶解條件為:加酶量為酪蛋白質(zhì)量的0.2%，反應(yīng)溫度50°C，反應(yīng)時間2 h，pH 9.0。將溫度調(diào)節(jié)至90°C，保溫20 min，進行滅酶滅菌。
[0030](2)調(diào)節(jié)pH值5.0，過濾除去大分子蛋白。濾液調(diào)節(jié)pH值4.6，過0.2 μπι規(guī)格的精濾裝置，進一步除去大分子物質(zhì)。精濾液調(diào)節(jié)PH值6.8，過300 Da納濾膜，除去一些小分子及鹽類，再過反滲透膜濃縮，得到濃縮液。
[0031](3)濃縮液調(diào)節(jié)pH值6.0，溫度10°C，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至60%，靜置4 h，
離心或過濾，收集沉淀。
[0032](4)沉淀用水溶解后過GlOO葡聚糖凝膠柱，用水洗脫，分別收集洗脫液前50 mL,50 - 100 mL，100 - 200 mL，濃縮后凍干。粉末用水溶解過QuikS印-100中壓柱層析柱系統(tǒng)，中壓柱自裝，中壓洗脫條件:流速20 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進樣量:5 mL ;流動相:A栗超純水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA), B栗初始濃度為10% ；洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度:0.01 min~35 min, 10%~20% ；35.01 min~125 min,20-27% ； 125.01 min~140 min,27%~90% ； 140.01 min~155 min，90%~90%，155.01 min~165min,90^10%o重復(fù)進樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰，收集洗脫峰后真空濃縮除去有機溶劑，冷凍干燥，得到初步純化的酪蛋白磷酸肽。粉末用水溶解，調(diào)節(jié)PH至6.0，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至70%，離心取沉淀。
[0033](5)反相硅膠純化。沉淀溶解再進行反相硅膠純化，HPLC系統(tǒng):LC_8A島津制備高效液相色譜儀；色譜柱:服一 0121 ;色譜條件:流速10 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進樣量:I mL ;流動相:A栗超純水(含0.1% (v/v)TFA)，B栗乙腈(含0.1% (v/v)TFA)，B栗初始濃度為5% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度:0.01 min?25 min，5%~18% ；25.01 min?85 min,18?30% ;85.01 min?95 min，309ir^70% ;95.01 min?120 min，70%~70%，120.01 min?150 min，70°/『5%。重復(fù)進樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。收集洗脫峰后真空濃縮除去有機溶劑，冷凍干燥，得到純化的酪蛋白磷酸肽。
[0034](6)再次反相硅膠純化。HPLC系統(tǒng):LC_15C島津高效液相色譜儀；色譜柱:C18，Ultimate? AQ_C18，5 μ m，4.6 X 250 mm;色譜條件:流速:1 mL/min ;檢測波長:215 nm ；進樣量:20 μ L ;流動相:Α栗超純水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA),B栗初始濃度為10% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度0~15 min, 10%~20% ； 15-50 min,20%~27% ；50.01 min?60 min,90% ；60.01 min?70 min，10%。重復(fù)進樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰后真空濃縮，除去有機溶劑，冷凍干燥，得到酪蛋白磷酸肽單體。
[0035]在上述條件下，得到酪蛋白磷酸肽在濃度為0.2g/L時，持鈣時間為30 min，得到酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，其分子量分別為1224.12,1082.14,1578.70Da，序列分別為 SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV、IGpSEpSTEDQAMEDIK、ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，酪蛋白磷酸肽的分子量在1000-2000Da之間，有利于人體吸收，酪蛋白磷酸肽單體在水中溶解性好、溶液澄清透明。
【主權(quán)項】
1.酪蛋白磷酸肽CPPl、CPP2、CPP3，其分子量分別為1224.12,1082.14、1578.70，CPPl 的序列為 SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，屬于 a s2 酪蛋白 68-84 的片段；CPP2的序列為IGpSEpSTEDQAMEDIK，屬于α SI酪蛋白59-73的片段；CPP3序列為ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，屬于 β 酪蛋白 17-39 的片段。2.一種酪蛋白磷酸肽單體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將酪蛋白加水溶解，再加入胰蛋白酶酶解，滅酶殺菌； (2)調(diào)節(jié)pH值4.0-5.0，過濾，將濾液調(diào)節(jié)pH值4.0-5.0，過0.2 μ m精濾進一再將精濾液調(diào)節(jié)PH值6.0-6.8，過納濾膜，再過反滲透膜； (3)將步驟(2)所得濃縮液調(diào)節(jié)pH值5.0-6.0，溫度5-10°C，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至40-60%，靜置4-6 h，離心或過濾，收集沉淀； (4)將步驟(3)所得沉淀用水溶解后過葡聚糖凝膠柱，收集洗脫液，凍干；粉末溶解過中壓柱層析柱，收集洗脫峰，凍干；粉末用水溶解，調(diào)節(jié)PH至5.0 - 6.0，再加入乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至50%-70%，離心取沉淀； (5)將步驟(4)所得沉淀用制備高效液相色譜儀反相硅膠純化，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰，真空濃縮，冷凍干燥，得到純化的酪蛋白磷酸肽； (6)將步驟(5)所得純化的酪蛋白磷酸肽用高效液相色譜儀進行反相硅膠純化，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰，真空濃縮，冷凍干燥，得到酪蛋白磷酸肽單體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酪蛋白磷酸肽單體的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，溶解時料水重量比為1:4-6，溶解溫度40-50 °C。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪蛋白磷酸肽單體的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，酶解條件為:加酶量為酪蛋白質(zhì)量的0.1%-0.2%，反應(yīng)溫度40°C_50°C，反應(yīng)時間I h -2 h，pH7.0_9.0 ο5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的酪蛋白磷酸肽單體的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，酶解條件為:加酶量為酪蛋白質(zhì)量的0.15%，反應(yīng)溫度45°C，反應(yīng)時間1.5 h，pH 8.0。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酪蛋白磷酸肽單體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，縮液調(diào)節(jié)PH值5.5，溫度8°C和乙醇濃度50%，靜置5 h。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酪蛋白磷酸肽單體的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述反相硅膠純化條件為:HPLC系統(tǒng):LC-8A島津制備高效液相色譜儀；色譜柱:服-0121 ;色譜條件:流速:10 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進樣量:1 mL ;流動相:A栗超純水，B栗乙腈，B栗初始濃度為5% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度:0.01 min~25 min，5%~18% ;25.01 min~85 min, 18-30% ；85.01 min~95 min, 30%~70% ；95.01 min~120 min, 70%~70%,120.01 min~150 min，70%~5%，重復(fù)進樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酪蛋白磷酸肽單體的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，所述反相硅膠純化條件為:HPLC系統(tǒng):LC-15C島津高效液相色譜儀；色譜柱:C18，Ultimate?AQ-C18，5 μπι，4.6X250 mm;色譜條件:流速:1 mL/min ;檢測波長:215 nm ;進樣量:20μ L ;流動相:Α栗超純水，B栗乙腈，B栗初始濃度為5% ;洗脫方式:二元梯度洗脫；洗脫梯度 0~19.5 min, 5%~18% ；19.5—55.5 min, 18%~30% ；55.01 min~65 min, 90% ；65.01 min~75min, 5%，重復(fù)進樣，收集酪蛋白磷酸肽洗脫峰。
【專利摘要】一種酪蛋白磷酸肽(CPP)單體及其制備方法，其以牛乳中酪蛋白為原料，經(jīng)過胰蛋白酶酶解、滅酶、精濾、醇沉、離心、過葡聚糖凝膠柱、中壓柱層析、反相硅膠純化、干燥等工藝制備持鈣活性高、具有特定序列的酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，其分子量分別為1224.12、1082.14、1578.70，CPP1的序列為SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，屬于αs2酪蛋白68-84的片段，CPP2的序列為IGpSEpSTEDQAMEDIK，屬于αS1酪蛋白59-73的片段；CPP3序列為ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，屬于β酪蛋白17-39的片段。本發(fā)明所得產(chǎn)品流動性好，25%酪蛋白磷酸肽的水溶液澄清透明，顏色為純白色粉末；分子量小，有利于人體吸收；磷酸絲氨酸殘基多，持鈣活性高，能應(yīng)用于以該特定序列的酪蛋白磷酸肽為活性成分的酪蛋白磷酸肽產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
【IPC分類】C07K1/16, C07K1/34, C07K7/08, C07K14/47, C07K1/20, C12P21/06
【公開號】CN105085651
【申請?zhí)枴緾N201510554374
【發(fā)明人】曹庸, 郭斌, 王海波, 李雙祁, 劉飛, 吳成順, 黃慧明, 彭維
【申請人】廣州綠萃生物科技有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月2日