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白芨多糖水凝膠、培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng)用與誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的方法

文檔序號:9366080閱讀:846來源:國知局
白芨多糖水凝膠、培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng)用與誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域,尤其涉及白芨多糖水凝膠、培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng)用與誘導(dǎo) 臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 健全的角膜上皮細胞是角膜抵御外界各種有害因素損傷的重要條件,結(jié)構(gòu)與功能 健全的角膜緣干細胞是角膜上皮細胞再生的主要來源。多種致病因素,如:眼外傷、手術(shù)創(chuàng) 傷、炎癥、藥物毒性均可造成角膜緣損傷,造成角膜緣干細胞功能障礙,導(dǎo)致上皮細胞缺失, 從而導(dǎo)致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危險。因此,通過體外培養(yǎng)獲得大量用于角膜 修復(fù)的上皮細胞這一難題亟待解決。臨床研究表明,通過體外培養(yǎng)自體角膜緣干細胞作為 角膜上皮修復(fù)的種子細胞取得了良好療效。但是,自體角膜緣干細胞體外連續(xù)培養(yǎng)所要求 的培養(yǎng)液成分復(fù)雜,細胞不穩(wěn)定易分化,細胞不能持續(xù)擴增,細胞表型發(fā)生改變,所以每次 移植都要在患者或其家屬的正常角膜上取下部分角膜緣組織進行體外培養(yǎng),操作繁瑣,且 給患者帶來二次痛苦,并且有研究者發(fā)現(xiàn)當取供眼角膜緣組織大于三分之二時,將造成健 眼的眼表疾病和視力不可逆的下降,使得大多數(shù)患者難以接受。因此,非常有必要尋找新的 自體和異體移植的細胞來源。
[0003] 臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)具有的低污染、來源充足、增殖旺盛等優(yōu)點,并且, 臍帶間充質(zhì)干細胞不受任何倫理及法理限制,因而吸引了眾多的研究者。但是,體外誘導(dǎo) hUC-MSCs向角膜上皮細胞分化十分困難。
[0004] 三維培養(yǎng)技術(shù)通過模擬體內(nèi)細胞生長微環(huán)境,建立細胞之間及胞外基質(zhì)的廣泛聯(lián) 系,通過形成一定的三維立體結(jié)構(gòu),促進細胞近似于在機體內(nèi)的基因表達、胞外基質(zhì)分泌及 細胞生物學(xué)功能活性,故其在干細胞在再生醫(yī)學(xué)及臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面有著非常大的發(fā) 展前景。完整的三維細胞培養(yǎng)體系需要由三部分組成,支架、種子細胞、培養(yǎng)系統(tǒng)缺一不可。 近年來支架材料的研究表明,水凝膠材料成為最熱門的研究方向。
[0005] 水凝膠是一類具有親水性但不能在水中溶解而只能發(fā)生溶脹的材料,是自然界中 普遍存在的一類物質(zhì)形態(tài)。水凝膠中的水可使溶于其中的低分子量物質(zhì)從其中滲透擴散, 具有膜的特性,凝膠的這一擴散特性可實現(xiàn)氧、營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和代謝廢物的排出,為細胞 生存提供一個類似活體組織的環(huán)境。水凝膠按材料來源可分為天然材料制備的水凝膠和合 成材料水凝膠以及兩者復(fù)合的水凝膠。天然水凝膠材料主要包括膠原、殼聚糖、藻酸鹽、瓊 脂糖、透明質(zhì)酸等。其優(yōu)點是細胞信號識別性好,可促進細胞的黏附、增殖和分化,有良好 的生物相容性及生物可降解性;缺點是來源有限,難于加工,難以保證不同批次材料的同一 性,存在免疫原性,降解速度、力學(xué)性能難以控制等問題。合成水凝膠是由親水性的聚合物 經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)形成的水溶脹體。聚異丙基丙烯酰胺,聚乙烯醇,聚乙二醇及其衍生物是 研究較多的合成材料。人工合成水凝膠材料不受來源的限制,容易加工成型,可根據(jù)需要調(diào) 整物理、化學(xué)、生物力學(xué)和降解性能。但是在實際運用中也發(fā)現(xiàn)了不少缺點:合成材料通常 存在細胞親和力、親水性以及細胞黏附性較差,缺乏細胞識別信號位點等缺陷。
[0006] 因此,應(yīng)當研發(fā)一種具備細胞外基質(zhì)功能,適合細胞生長發(fā)育的人工仿生微環(huán)境 的水凝膠,并將其用于細胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供白芨多糖水凝膠、培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng) 用與誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的方法。本發(fā)明提供的白芨多糖水凝膠為 白芨多糖經(jīng)硫酸化修飾后與e_聚賴氨酸交聯(lián)獲得,該凝膠能夠在體外為細胞提供能貼近 體內(nèi)的微環(huán)境。采用該凝膠作為支架誘導(dǎo)誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化能夠 顯著提高細胞的分化率。
[0008] 本發(fā)明提供的白芨多糖水凝膠的制備方法為:由白芨多糖經(jīng)硫酸化后以e-聚賴 氨酸交聯(lián)制得白芨多糖水凝膠。
[0009] 白芨(Bletillastriata)為蘭科白芨屬多年生草本植物,以干燥的塊莖入藥。白 芨多糖具有的良好吸濕性和親水性,能促進氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和其它水溶性代謝產(chǎn)物的通透 作用,同時還能加強上皮和基質(zhì)細胞的粘附性。本發(fā)明將白芨多糖經(jīng)硫酸化后與攜帶多官 能團的e-聚賴氨酸交聯(lián)制得多糖水凝膠。本發(fā)明提供的白芨多糖水凝膠與白芨多糖溶液 自身形成的水凝膠相比,具有更加良好的孔隙,和更高的粘度。并且,該制備方法操作簡單, 成膠時間短。本發(fā)明提供的白芨多糖水凝膠能夠在體外提供為細胞提供與體內(nèi)相似的微環(huán) 境,從而更加有利于細胞的生長和分化。
[0010] 在本發(fā)明的實施例中,白發(fā)多糖的制備方法為:將白發(fā)粉碎后經(jīng)水提醇沉,所得沉 淀以水重懸,以氯仿和丁醇的混合物抽提后,經(jīng)30000D~50000D透析,干燥制得白芨多糖。
[0011] 在一些實施例中,水提醇沉具體為:將白芨粉以水浸提后,提取液與乙醇水溶液混 合,靜置過夜制得沉淀。
[0012] 在一些實施例中,浸提的溫度為80°C,浸提的時間為4h。
[0013] 在一些實施例中,乙醇水溶液中乙醇的體積分數(shù)為95 %。
[0014] 在一些實施例中,乙醇水溶液與提取液的體積比為1:3。
[0015] 經(jīng)過氯仿和丁醇的混合液抽提后,提取物中的蛋白被去除。離心后取水相。
[0016] 在一些實施例中,氯仿和丁醇的混合物中,氯仿和丁醇的體積比為5:1。
[0017] 在一些實施例中,沉淀溶于水后溶液的體積是氯仿和丁醇混合物的3倍。
[0018] 在一些實施例中,透析采用的透析液為蒸餾水。
[0019] 在一些實施例中,干燥為凍干。
[0020] 本發(fā)明制得白芨多糖的分子量為30000D~50000D。
[0021] 在一些實施例中,干燥后的白芨多糖還經(jīng)過純化。
[0022] 在一些實施例中,純化為將凍干后的白芨多糖溶解后,過交聯(lián)葡聚糖G-100柱。
[0023] 在本發(fā)明的實施例中,硫酸化的方法為氯磺酸-吡啶法。
[0024] 在一些實施例中,硫酸化的試劑為氯磺酸與吡啶。
[0025] 在一些實施例中,氯磺酸與吡啶的體積比為1:6。
[0026] 在本發(fā)明的實施例中,白芨多糖的硫酸化具體為:將白芨多糖溶于無水N,N-二甲 基甲酰胺,室溫攪拌30min后,加入硫酸化試劑(氯磺酸與吡啶的體積比為1:6),置于60°C 水浴攪拌反應(yīng)3h。
[0027] 在一些實施例中,經(jīng)硫酸化后,調(diào)整pH值為7. 5,減壓濃縮后以蒸餾水為透析液透 析3d,透析液濃縮后經(jīng)冷凍干燥得到硫酸化多糖。
[0028] 在本發(fā)明的實施例中,e_聚賴氨酸溶液的分子量為600Da~4300Da,其中包括25 個~30個賴氨酸殘基。
[0029] 在本發(fā)明的實施例中,交聯(lián)具體為,將硫酸化的白芨多糖溶液與e_聚賴氨酸溶 液混合后靜置。
[0030] 在一些實施例中,e -聚賴氨酸溶液的溶劑為PBS緩沖液,其中e -聚賴氨酸的質(zhì) 量分數(shù)為3%。
[0031] 在本發(fā)明的實施例中,硫酸化的白芨多糖溶液的溶劑為PBS緩沖液,其中硫酸化 白芨多糖的濃度為200 y g/mL。
[0032] 在本發(fā)明的實施例中,交聯(lián)的溫度為18°C~35°C,時間為20s~40s。
[0033] 在一些實施例中,交聯(lián)的時間為30s。
[0034] 本發(fā)明提供方法制備的白芨多糖水凝膠。
[0035] 本發(fā)明提供的白芨多糖水凝膠呈半透明膜狀,其中具有良好的孔隙,適宜細胞的 生長與分化。實驗表明,以本發(fā)明提供的白芨多糖水凝膠為支架,將hUC-MSCs與羊膜上皮 細胞共培養(yǎng)7天后,hUC-MSCs的分化率可達31. 96%。且細胞生長旺盛,呈球圓形。
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