種 密度為IXIO5個/孔。每孔加入2. 5ml含lOOU/mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為 55%LONZA人干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（LonzaUltra⑶LTURE?) ,45%角朊細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 (Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培養(yǎng)液，25ng/ml表皮生長因子（EGF)，25ug/ ml胰島素的完全培養(yǎng)液。
[0109] 每隔2-3天更換新的培養(yǎng)液。培養(yǎng)7天后取出細(xì)胞爬片。
[0110] 倒置顯微鏡下觀察：培養(yǎng)7d后，細(xì)胞生長緩慢，可見少許集落；培養(yǎng)至第14d，細(xì)胞 體積有見增大。
[0111] 掃描電鏡觀察：繼續(xù)培養(yǎng)7天后可見細(xì)胞粘附于支架上，與支架包裹在一起；將其 放大至2000倍，可見明顯的細(xì)胞，其"偽足"牢牢抓住支架間隙。
[0112] 按照免疫組化染色SP法試劑盒的說明書進行細(xì)胞角蛋白AEl和AE5的免疫組化 染色，DAB顯色。AEl免疫組化染色結(jié)果表明，可見少許AEl抗體DAB著色細(xì)胞，呈散在分 布，而且細(xì)胞著色較淡。AE5抗體淡著色。
[0113] 實施例8
[0114] 在transwell小室的下室中制備白芨多糖凝膠。方法如實施例3。將0. 5mL多糖 溶液加入六孔板，加入等體積的交聯(lián)劑，室溫靜置30s。
[0115] 取增殖對數(shù)期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮細(xì)胞，接種于Transwell共 培養(yǎng)體系中，上室植入羊膜上皮細(xì)胞接種密度為4XIO5個/孔，下室植入hUC-MSCs，接種密 度為I. 5XIO5個/孔。每孔加入2. 5ml含lOOU/mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為 55%LONZA人干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（LonzaUltra⑶LTURE?) ,45%角朊細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 (Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培養(yǎng)液，5ng/ml表皮生長因子（EGF)，5ug/ml 胰島素的完全培養(yǎng)液。
[0116] 每隔2-3天更換新的培養(yǎng)液。培養(yǎng)7天后取出細(xì)胞爬片。
[0117] 倒置顯微鏡下觀察：培養(yǎng)7d后，細(xì)胞生長緩慢，可見少許集落；培養(yǎng)至第14d，細(xì)胞 體積有見增大。
[0118] 掃描電鏡觀察：繼續(xù)培養(yǎng)7天后可見少量細(xì)胞粘附于支架上，與支架包裹在一起； 將其放大至2000倍，可見明顯的細(xì)胞，其"偽足"牢牢抓住支架間隙。
[0119] 按照免疫組化染色SP法試劑盒的說明書進行細(xì)胞角蛋白AEl和AE5的免疫組化 染色，DAB顯色。免疫組化染色結(jié)果表明，可見少許AEl抗體DAB著色細(xì)胞。呈散在分布， 而且細(xì)胞著色較淡。AE5抗體淡著色。
[0120] 對比例1
[0121] 取增殖對數(shù)期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮細(xì)胞，接種于Transwell共 培養(yǎng)體系中，上室植入羊膜上皮細(xì)胞接種密度為4XIO5個/孔，下室植入hUC-MSCs，接種密 度為IXIO5個/孔。
[0122] 培養(yǎng)板上不添加任何凝膠，每孔加入2. 5ml含lOOU/mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素， 體積分?jǐn)?shù)為55 %LONZA人干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（LonzaUltra⑶LTURE?) ,45%角朊細(xì)胞無 血清培養(yǎng)基（Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培養(yǎng)液，10ng/ml表皮生長因子 (EGF)，lOug/ml胰島素的完全培養(yǎng)液。
[0123] 每隔2-3天更換新的培養(yǎng)液。培養(yǎng)7天后取出細(xì)胞爬片。
[0124] 倒置顯微鏡下觀察：培養(yǎng)7d后，細(xì)胞則呈梭形，單層融合生長。繼續(xù)培養(yǎng)至14d， 可見細(xì)胞體積有見增大。
[0125]按照免疫組化染色SP法試劑盒的說明書進行細(xì)胞角蛋白AEl和AE5及P63的免 疫組化染色，DAB顯色。免疫組化染色結(jié)果表明，可見少許DAB著色細(xì)胞。呈散在分布而且 細(xì)胞著色較淺。
[0126] 實施例9
[0127] 對實施例6~8及對比例1所得細(xì)胞經(jīng)免疫組化檢測后，對AEl、AE5染色的細(xì)胞 進行計數(shù)，計算出兩組的分化率進行比較。每組取樣3次，分別檢測后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0128] 誘導(dǎo)分化率=染色陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)X100%。
[0129] 統(tǒng)計結(jié)果如表2:
[0130] 表2各組細(xì)胞分化率
[0131]
[0132] 注：同列肩標(biāo)不同字母表示具有顯著性差異（p〈0. 01)
[0133] 實驗表明，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，7天后臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞部分呈分化趨勢，細(xì)胞呈散在分布，經(jīng)檢測，hUC-MSCs分化為角膜上皮細(xì)胞的分化率可 達(dá)31. 96%。而沒有采用凝膠支架的對比例中hUC-MSCs的分化率為26. 52% ;可見，本發(fā) 明提供的方法能夠提高h(yuǎn)UC-MSCs向角膜上皮細(xì)胞分化的百分率，該效果具有顯著性差異 (p〈0. 01)。
[0134] 以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 白芨多糖水凝膠的制備方法，其特征在于，由白芨多糖經(jīng)硫酸化后以e-聚賴氨酸 交聯(lián)制得白芨多糖水凝膠。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述白芨多糖的制備方法為：將白 芨粉碎后經(jīng)水提醇沉，所得沉淀以水重懸，以氯仿和丁醇的混合物抽提后，經(jīng)30000D~ 50000D透析，干燥制得白芨多糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述硫酸化的試劑為氯磺酸與吡啶 的混合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)的溫度為18°C~35°C，時間 為 20s ~40s。5. 權(quán)利要求1~4任一項所述制備方法制得的白芨多糖水凝膠。6. 權(quán)利要求1~4任一項所述制備方法制得的白芨多糖水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)或誘導(dǎo)分化 中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化為誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 向角膜上皮細(xì)胞分化。8. 誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化的方法，其特征在于，以權(quán)利要求1~ 4任一項所述制備方法制得的白芨多糖水凝膠為支架，在培養(yǎng)液存在條件下，將臍帶間充質(zhì) 干細(xì)胞與羊膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)；所述培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、表皮生長因子和胰島素。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述表皮生長因子與胰島素的質(zhì)量比為 (5 ~25) : (5000 ~25000)。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與羊膜上皮細(xì)胞 的個數(shù)比為（1~1. 5) : (4~6)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及白芨多糖水凝膠、培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng)用與誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明將白芨多糖經(jīng)硫酸化后與攜帶多官能團的ε-聚賴氨酸交聯(lián)制得多糖水凝膠。該白芨多糖水凝膠呈半透明膜狀，其中具有良好的孔隙，適宜細(xì)胞的生長與分化。實驗表明，以本發(fā)明提供的白芨多糖水凝膠為支架，將hUC-MSCs與羊膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)7天后，hUC-MSCs的分化率可達(dá)31.96％。該分化率顯著(p<0.01)未采用凝膠支架的對比例。并且，本發(fā)明提供的凝膠還能夠使細(xì)胞生長旺盛，縮短誘導(dǎo)時間。
【IPC分類】C08L5/00, C08J3/075, C12N5/071, C08L77/02, C08B37/00, C08J3/24
【公開號】CN105085938
【申請?zhí)枴緾N201510540753
【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 戚康藝
【申請人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月28日