雙嵌合抗原受體修飾的t淋巴細(xì)胞及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療（adoptivecellularimmunotherapy,ACI)是指將體外激 活的自體或異體免疫效應(yīng)細(xì)胞輸注給患者，以殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，是目前治療惡性 腫瘤的重要手段之一，已在多種實(shí)體瘤和血液腫瘤的臨床治療中取得較好療效。其中，嵌合 抗原受體（chimericantigenreceptor，CAR)修飾的T淋巴細(xì)胞技術(shù)是新近迅速發(fā)展的一 種細(xì)胞治療技術(shù)，通過(guò)基因工程技術(shù)修飾效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境 和宿主免疫耐受狀態(tài)，提高了抗腫瘤的靶向性、殺傷活性和持久性。
[0003]目前，大多數(shù)CAR由胞外抗原結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。胞外抗原 結(jié)合區(qū)由來(lái)源于單克隆抗體的輕鏈（VL)和重鏈（VH)的可變區(qū)組成，中間由帶韌性的鉸鏈 區(qū)連接形成單鏈抗體（singlechainfragmentvariable,scFv)。CAR通過(guò)將識(shí)別腫瘤 抗原的scFv和胞內(nèi)信號(hào)域"免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-based activationmotifs，ITAM) "在體外進(jìn)行基因重組，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)修飾患者的T淋巴細(xì) 胞，使患者T淋巴細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原受體，經(jīng)過(guò)純化和大規(guī)模擴(kuò)增修飾后的T淋巴細(xì)胞，稱 為嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞（CAR-T)。
[0004] 目前CAR-T淋巴細(xì)胞技術(shù)發(fā)展到了第三代。第一代CAR由單鏈抗體通過(guò)跨膜區(qū)域 與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)（ITAM)相連，ITAM通常為⑶3GSFceRIy;第二代CAR的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)區(qū)引入了共刺激分子（costimulatorymolecule，CM)，主要為⑶28分子；第三代CAR引 入了雙共刺激分子（CM1和CM2)，主要為⑶28分子加上⑶134或⑶137等。第一代CAR-T 淋巴細(xì)胞研究較多，但是大多數(shù)試驗(yàn)在細(xì)胞擴(kuò)增、體內(nèi)存活時(shí)間、細(xì)胞因子分泌等方面還存 在不足，沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的臨床效果。研究表明，T淋巴細(xì)胞的完全活化有賴于雙信號(hào)和細(xì) 胞因子的作用。其中第一信號(hào)為特異性信號(hào)，由TCR識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞表面的抗原肽-MHC 復(fù)合物所啟動(dòng)；第二信號(hào)為協(xié)同刺激信號(hào)，通過(guò)⑶28/B7等重要的共刺激分子，促進(jìn)IL-2合 成，并使T淋巴細(xì)胞充分活化及免于凋亡。即使T淋巴細(xì)胞與抗原接觸，如果沒(méi)有協(xié)同刺激 信號(hào)，細(xì)胞難以發(fā)揮正常功能。相應(yīng)的，僅含有CD3G序列的嵌合抗原受體，如沒(méi)有協(xié)同刺 激信號(hào)2,也難以高效激活CAR-T淋巴細(xì)胞。因此，依照T淋巴細(xì)胞活化的雙信號(hào)學(xué)說(shuō)，第二 和第三代CAR在嵌合抗原受體上加上如⑶28、⑶137等共刺激分子，以提高T淋巴細(xì)胞的細(xì) 胞毒性、增殖活性，維持T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，延長(zhǎng)T淋巴細(xì)胞存活時(shí)間等。研究證實(shí)第二代的 CAR-T淋巴細(xì)胞在殺瘤活性和體內(nèi)存活時(shí)間均優(yōu)于第一代。目前第三代CAR-T淋巴細(xì)胞臨 床應(yīng)用還比較少，其結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、安全性和有效性還需進(jìn)一步觀察和優(yōu)化。
[0005]CAR-T淋巴細(xì)胞臨床應(yīng)用的首要風(fēng)險(xiǎn)是脫靶效應(yīng)，可導(dǎo)致針對(duì)正常組織的自身免 疫反應(yīng)，主要是由于目前已知的腫瘤特異性抗原較少，大多數(shù)CAR針對(duì)的是重要組織不表 達(dá)或表達(dá)較少的腫瘤相關(guān)抗原。因此，如何提高CAR-T淋巴細(xì)胞的靶向性是目前臨床應(yīng)用 面臨的首要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明構(gòu)建低親和力嵌合抗原受體（chimericantigenreceptor，CAR-L)和高親 和力嵌合抗原受體（CAR-H)，分別識(shí)別兩種腫瘤相關(guān)抗原，并且分別含有CD3G序列和CM序 列，將它們同時(shí)轉(zhuǎn)染至T淋巴細(xì)胞中，修飾后的T淋巴細(xì)胞只有同時(shí)識(shí)別兩種腫瘤相關(guān)抗原 才能被有效激活，增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤的靶向性，降低對(duì)正常組織的損傷。
[0007] 本發(fā)明的第一方面是提供一種雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞（BiCAR-T)，所 述T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)兩種嵌合抗原受體。
[0008] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合抗原受體CAR-L是通過(guò)氨基端到羧基端順 次拼接所述的靶向EGBB2的單鏈抗體、CDSa鉸鏈區(qū)及跨膜區(qū)、和CD3G鏈胞內(nèi)區(qū)，所得到的 嵌合抗原受體CAR-L的結(jié)構(gòu)為ERBB2 (scFv)-CD8a-CD3G，其氨基酸序列如SEQIDNO:1 所示，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0009] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合抗原受體CAR-H是通過(guò)氨基端到羧基端 順次拼接所述的靶向EGFR的單鏈抗體、CD8a鉸鏈區(qū)、CD28跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)、和可誘導(dǎo)協(xié)同 刺激分子（inducibleco-stimulator,IC0S)胞內(nèi)區(qū)，所得到的嵌合抗原受體CAR-H的結(jié) 構(gòu)為EGFR(scFv)-CD8a-CD28-IC0S，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，其編碼核苷酸序 列如SEQIDNO:4所示。
[0010] 在本發(fā)明中，所述靶向EGBB2的單鏈抗體對(duì)靶向蛋白具有低親和力，Kd值>2nM;所 述靶向EGFR的單鏈抗體對(duì)靶向蛋白具有高親和力，&值〈0. 5nM。
[0011] 本發(fā)明的第二方面是所述雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)嵌合抗原 受體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第三方面是提供所述雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞的制備方法，具 體步驟如下： (1) 通過(guò)PCR方法獲得編碼人源ERBB2單鏈抗體的核苷酸片段； (2) 通過(guò)PCR方法獲得編碼⑶8a鉸鏈區(qū)及跨膜區(qū)和⑶3G鏈胞內(nèi)區(qū)的核苷酸片段； (3) 將步驟（1)和（2)獲得核苷酸片段依次裝入載體p⑶H-CMV-MCS;從而獲得含有嵌 合抗原受體CAR-L基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，命名為p⑶H-ERBB2-⑶3G(CAR-L); (4) 合成已知編碼人源EGFR單鏈抗體的核苷酸片段； (5) 通過(guò)PCR方法獲得編碼⑶8a鉸鏈區(qū)、⑶28跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)、和ICOS胞內(nèi)區(qū)的核 苷酸片段； (6) 將步驟（4)和（5)獲得核苷酸片段依次裝入載體p⑶H-CMV-MCS;從而獲得含有嵌 合抗原受體CAR-H基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，命名為p⑶H-EGFR-⑶28-IC0S(CAR-H); (7) 將慢病毒轉(zhuǎn)移載體pCDH-EGFR-CD28-IC0S(CAR-H)和pCDH-ERBB2-CD3G(CAR-L) 轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞；包裝獲得病毒顆粒，經(jīng)離心濃縮后獲得高滴度的慢病毒懸液； (8) 慢病毒懸液感染T淋巴細(xì)胞從而獲得雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞 (BiCAR-T)0
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面將進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。需要指出的是，以下說(shuō)明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求 保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說(shuō)明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附 權(quán)利要求書(shū)記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0014] 實(shí)施例ICAR-L表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建 根據(jù)基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)對(duì)ERBB2的胞外配體結(jié)合區(qū)RLD蛋白高特異性和低親和性的ERBB2scFv抗體的核苷酸序列（核苷酸序列如SEQIDNo:5所示）;且在兩端加上限制性內(nèi) 切酶EcoRI位點(diǎn)。通過(guò)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ERBB2scFv抗體，經(jīng)ELISA測(cè)定其對(duì)RLD蛋白親和力 的Kd值為2. 14nM。
[0015] 按照Genebank(NCBI)中⑶8a及⑶3G基因序列設(shè)計(jì)合成嵌合抗原受體CAR-L 的Hinge-TM-⑶3G表達(dá)框，包括⑶8a鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)（aa135_205)及⑶3G鏈胞內(nèi)區(qū) (aa52-163)，合成基因序列。設(shè)計(jì)引物，在引物兩端分別加上限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI 位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增上述基因序列。EcoRI、BamHI雙酶切慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p⑶H-CMV-MCS，置于 37°C水浴中反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒過(guò)柱回收。用SolutionI連接酶 將Hinge-TM-⑶3G片段插入到載體基因片段中。將連接體系全部加入裝有DH5a感受態(tài) 細(xì)胞，涂在氨芐青霉素抗性的LB平板上，正置約半小時(shí)待菌液基本被吸收，放入37°C培養(yǎng) 箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上Amp篩選的單個(gè)克隆，按質(zhì)粒DNA少量提取試劑盒操作說(shuō)明 擴(kuò)增連接產(chǎn)物。提取質(zhì)粒，用EcoRI、BamHI雙酶切來(lái)鑒定，符合要求的命名為p⑶H-⑶3G。
[0016]EcoRI酶切質(zhì)粒p⑶H-⑶:3G，置于37°C水浴中反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后用PCR產(chǎn)物純 化試劑盒過(guò)柱純化回收。向酶切產(chǎn)物中加入IMLFastAP(使切開(kāi)的載體末端去磷酸化)， 37°C水浴中反應(yīng)10min，然后置于70°C電熱烘干機(jī)中滅活酶10min，過(guò)柱純化回收載體片 段。用SolutionI連接酶將ERBB2scFv目的片段插入到載體基因片段中，4°C連接過(guò)夜。 將連接體系放入70°C水浴滅活酶10min，置冰上冷卻。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì) 胞，經(jīng)冰浴30min，42 °C水浴熱休克90s，再次立即置于冰上5min，加入LB液體培養(yǎng)基搖 菌后，將菌液涂在氨芐青霉素（Amp+)抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日觀 察平板上菌落生長(zhǎng)情況。挑取平板上Amp篩選的單個(gè)克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定，用1%瓊脂 糖凝膠電泳分析，篩選出擴(kuò)增條帶與預(yù)期相符的單克隆菌。將篩選出的單克隆余下的水溶 菌液加到2. 5mL含2. 5ML氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜搖菌，擴(kuò)大培養(yǎng)。次日，保 存一部分菌液為15%的甘油菌于-100°C冰箱中。剩余菌液用質(zhì)粒DNA少量提取試劑盒提取 質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。經(jīng)鑒定符合要求的含有嵌合抗原受體基因片段的 慢病毒轉(zhuǎn)移載體，命名為P⑶H-ERBB2-⑶3G(CAR-L);測(cè)序表明，編碼CAR-L的各基因片段 ERBB2scFv、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和⑶3G序列和連接正確，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示， 其編碼氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0017] 實(shí)施例2CAR-H表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建 根據(jù)基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)對(duì)PEP3-KLH抗原高特異性和高親和性的EGFRscFv抗體的核 苷酸序列(核苷酸序列如SEQIDNo:6所示);且在兩端加上限制性內(nèi)切酶EcoRI位點(diǎn)。通過(guò) 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EGFRscFv抗體，經(jīng)ELISA測(cè)定其對(duì)PEP3-KLH抗原親和力的Kd值為0. 47nM。
[0018]根據(jù)Genebank(NCBI)中⑶8a、⑶28及ICOS基因序列設(shè)計(jì)合成⑶8a鉸鏈區(qū)、 CD28跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)、和ICOS胞內(nèi)區(qū)基因序列。設(shè)計(jì)引物，在引物兩端分別加上限制性內(nèi) 切酶EcoRI、BamHI位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增上述基因序列。將膠回收后的目的片段雙酶切，置于37°C 水浴中反應(yīng)4h，使兩端帶有粘性末端，反應(yīng)結(jié)束后取4ML上樣經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析， 純化獲取兩端帶有粘性末端的Hinge-TM-⑶28-IC0S目的片段。
[0019]EcoRI、BamHI雙酶切慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p⑶H-CMV-MCS，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒過(guò)柱 回收。用SolutionI連接酶將Hinge-TM-CD28-IC0S片段插入到載體基因片段中，4°C連接 過(guò)夜。將連接體系加入裝有DH5a感受態(tài)細(xì)胞的EP管中，混勻后置于冰上30min，42°C水 浴熱休克90s，迅速置于冰上5min，加入600MLLB液體培養(yǎng)基(不含抗生素）放入37°C 水平搖床（180r/min)搖菌lh，6000r/min離心2min，棄去上清450ML，剩余的輕輕吹打 混勻后涂在氨芐青霉素（Amp+)抗性的LB平板上，正