置約半小時(shí)，放入37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 過(guò)夜。挑取平板上Amp篩選的單個(gè)克隆擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，用EcoRI、BamHI雙酶切來(lái)鑒定，符 合要求的命名為PCDH-CD28-IC0S。
[0020]EcoRI酶切質(zhì)粒pCDH-CD28-IC0S，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒過(guò)柱純化回收。向酶切 產(chǎn)物中加入IMLFastAP(使切開(kāi)的載體末端去磷酸化)，37°C水浴中反應(yīng)lOmin，然后置于 70°C電熱烘干機(jī)中滅活酶lOmin，過(guò)柱純化回收載體片段。用SolutionI連接酶將EGFR scFv目的片段插入到載體基因片段中，4°C連接過(guò)夜。將連接體系放入70°C水浴滅活酶10 min，置冰上冷卻。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)冰浴30min，42°C水浴熱休克 90s，再次立即置于冰上5min，加入LB液體培養(yǎng)基搖菌后，將菌液涂在氨芐青霉素（Amp+) 抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況。挑取平板 上Amp篩選的單個(gè)克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，篩選出擴(kuò)增條帶 與預(yù)期相符的單克隆菌。將篩選出的單克隆余下的水溶菌液加到2. 5mL含2. 5ML氨芐 青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜搖菌，擴(kuò)大培養(yǎng)。次日，保存一部分菌液為15%的甘油菌 液于-KKTC冰箱中。剩余菌液用質(zhì)粒DNA少量提取試劑盒提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行 DNA測(cè)序鑒定。經(jīng)鑒定符合要求的含有嵌合共刺激受體基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，命名為 PCDH-EGFR-CD28-IC0S(CAR-H)，其核苷酸序列如SEQIDN0:4所示，其編碼氨基酸序列如 SEQIDNO: 3 所示。
[0021] 實(shí)施例3T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)檢測(cè) 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293FT細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基 并以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基沖洗，將20 y L脂質(zhì)體Lipofectamine? 2000加至500 y L的無(wú)血 清DiffiM培養(yǎng)基，充分振蕩后快速加入兩種重組質(zhì)粒CAR-L/CAR-H 15 yg、A8. 2 10 yg、 VSV-G 5 y g，靜置20 min移至293FT細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；6 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h 熒光顯微鏡下觀察，72 h后收集病毒上清，5000 rpm低溫離心10 min，去除漂浮細(xì)胞及細(xì)胞 碎片。ELISA法檢測(cè)病毒滴度后置于-80°C保存。
[0022] 抽取50mL健康志愿者的新鮮外周血，通過(guò)常規(guī)方法獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)。用適量的MACS緩沖液（按1.5mL/107個(gè)PBMC)洗滌細(xì)胞一次，800r/min離心 10min沉淀細(xì)胞，棄上清。用適量的MACS緩沖液重懸細(xì)胞（按80ML/107個(gè)PBMC)后，加 入適量的antihuman-CD3免疫磁珠(按20ML/107個(gè)PBMC)混勻，4°C孵育15min。再加入 適量的MACS緩沖液洗滌細(xì)胞（按I. 5mL/107個(gè)PBMC)，800r/min離心10min沉淀細(xì)胞， 棄上清，用500MLMACS緩沖液重懸細(xì)胞。將MS分離柱放入MiniMACS分離器上，用500ML MACS緩沖液洗滌分離柱一次。加入細(xì)胞懸液于MS分離柱內(nèi)，先流出來(lái)的細(xì)胞是未被磁珠 標(biāo)記的CD3-細(xì)胞。用500MLMACS緩沖液洗滌分離柱三次，從MiniMACS分離器上取下MS 分離柱，放到15mL離心管上。加入ImLMACS緩沖液至分離柱上，迅速將滯留的細(xì)胞洗 脫下來(lái)，洗脫液即為分離的⑶3+T淋巴細(xì)胞。加入適量的MACS緩沖液，充分混勻后計(jì)數(shù)。 1000r/min離心10min，棄上清。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度 至IXIO6AiL于6孔板中。將培養(yǎng)板置于37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0023] 按照人T淋巴細(xì)胞⑶3/⑶28免疫激活磁珠說(shuō)明書(shū)激活T淋巴細(xì)胞。將分離出的 ⑶3+T淋巴細(xì)胞以每孔IXIO6個(gè)鋪于24孔板上。每孔加入25ML已預(yù)洗的磁珠，加入重 組人IL-2使終濃度為30U/mL。將24孔板置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3d更 換含有重組人IL-2的培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度進(jìn)行傳代。
[0024] 當(dāng)⑶3+T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，密度為70%左右時(shí)可進(jìn)行感染。將Polybrene 加入24孔板中至終濃度為4yg/mL，同時(shí)加入慢病毒懸液CAR-L/CAR-H，第四天換液繼續(xù) 培養(yǎng)并凍存。慢病毒感染目的細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法，鋪96孔板（80cells/plate)，37°C、5% 〇)2至細(xì)胞克隆長(zhǎng)出，挑選單克隆細(xì)胞鑒定陽(yáng)性克隆，即獲得雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴 細(xì)胞（BiCAR-T)。
[0025] 實(shí)施例4BiCAR-T體外殺瘤活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同的靶細(xì)胞分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組：空 白對(duì)照組（4T1細(xì)胞)、ERBB2組(轉(zhuǎn)染了ERBB2的4T1細(xì)胞)、EGFR組(轉(zhuǎn)染了EGFR的4T1細(xì) 胞)、ERBB2-EGFR組(轉(zhuǎn)染了ERBB2和EGFR的4T1細(xì)胞)，設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組和靶細(xì)胞對(duì) 照組。調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞BiCAR-T(實(shí)施例3制備）和各組相應(yīng)的靶細(xì)胞密度，分別為IXIO6/ mL和lXl〇7mL，在各實(shí)驗(yàn)組中按效靶比5 :1、10 :1、20 :1、40 :1往96孔板加入效應(yīng)細(xì)胞懸 液和靶細(xì)胞懸液，總體積為200ML，放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后每孔加入20 uLCCK-8,繼續(xù)孵育2h后上酶標(biāo)儀檢測(cè)，于450nm讀取OD值，殺傷率=【1-(實(shí)驗(yàn)組OD 值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值）/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值】X100%。
實(shí)施例5BiCAR-T分泌IFN-y的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)施例4,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取出已包被抗體的酶標(biāo)板，設(shè)置TMB空白顯色 孔，依次加入0.ImL按一定倍數(shù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和用樣品稀釋液稀釋的樣品。酶標(biāo)板加上蓋， 37°C反應(yīng)90min。反應(yīng)后用自動(dòng)洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體。將生物素抗人IFN-y抗體 工作液按每孔〇.ImL依次加入（TMB空白顯色孔除外)，37°C反應(yīng)60min，0.OlMPBS洗滌3 次。將ABC工作液按每孔0.ImL依次加入（TMB空白顯色孔除外)，37°C反應(yīng)30min，0.01M PBS洗滌5次。按每孔90yL依次加入TMB顯色液，37°C避光反應(yīng)20-25min，按每孔0. 1 mL依次加入TMB終止液，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD值。樣品OD值減 去空白孔OD值后以O(shè)D值及標(biāo)準(zhǔn)品濃度為XY軸繪圖，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查找IFN-y濃度后乘 以稀釋倍數(shù)，計(jì)算樣本中IFN-Y濃度；具體結(jié)果如下：

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量后調(diào)整細(xì)胞濃度，每只小鼠右側(cè)背部 皮下接種IXIO7個(gè)細(xì)胞。待腫瘤體積達(dá)到300-400mm3時(shí)，計(jì)數(shù)BiCAR-T(實(shí)施例3制備)濃 度調(diào)整至2XIO8個(gè)/mL，尾靜脈注射小鼠100yL/只，隔一天注射一次，共三次；對(duì)照組注射 未進(jìn)行雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞。接種腫瘤30天后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)與 寬，計(jì)算腫瘤體積并統(tǒng)計(jì)生存率。
[0027] 另外，設(shè)計(jì)以下對(duì)比例用于對(duì)比試驗(yàn)，具體如下： 對(duì)比例1 :僅包含CAR-L(實(shí)施例1制備)的T細(xì)胞，給藥量同實(shí)施例3制備的BiCAR-T細(xì)胞； 對(duì)比例2 :僅包含CAR-H(實(shí)施例2制備)的T細(xì)胞，給藥量同實(shí)施例3制備的BiCAR-T細(xì)胞； 具體結(jié)果如下：
本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說(shuō)明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方 案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技 術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容 中具體記載一樣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞，所述T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)雙嵌合抗原受體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞，其特征在于，所述嵌合抗原受 體CAR-L是通過(guò)氨基端到羧基端順次拼接所述的靶向ERBB2的單鏈抗體、CD8 a鉸鏈區(qū)及 跨膜區(qū)、⑶3(6鏈胞內(nèi)區(qū)，所得到的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)為ERBB2(scFV)-⑶8a-⑶3(6。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞，其特征在于，所述嵌合抗原 受體CAR-L的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞，其特征在于，所述嵌合抗原 受體CAR-L的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞，其特征在于，所述嵌合 抗原受體CAR-H是通過(guò)氨基端到羧基端順次拼接所述的靶向EGFR的單鏈抗體、CD8 a 鉸鏈區(qū)、CD28跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)及ICOS胞內(nèi)區(qū)，所得到的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)為EGFR (scFv) -CD8 a -CD28-IC0S。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞，其特征在于，所述嵌合抗原 受體CAR-H的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞，其特征在于，所述嵌合抗原 受體CAR-H的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用。9. 一種制備權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞的方法，具體步 驟如下： (1) 通過(guò)PCR方法獲得人源編碼低親和力ERBB2單鏈抗體的核苷酸片段； (2) 通過(guò)PCR方法獲得編碼⑶8a鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)以及⑶3G鏈胞內(nèi)區(qū)的核苷酸片段； (3) 將步驟（1)和（2)獲得核苷酸片段依次裝入載體p⑶H-CMV-MCS ;從而獲得含有嵌 合抗原受體CAR-L基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，命名為p⑶H-ERBB2-⑶3 G (CAR-L); (4) 通過(guò)PCR方法獲得已知人源編碼高親和力EGFR單鏈抗體的核苷酸片段； (5) 通過(guò)PCR方法獲得編碼⑶8 a鉸鏈區(qū)、⑶28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)以及ICOS胞內(nèi)區(qū)的核 苷酸片段； (6) 將步驟（4)和（5)獲得核苷酸片段依次裝入載體p⑶H-CMV-MCS ;從而獲得含有嵌 合抗原受體CAR-H基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，命名為p⑶H-EGFR-⑶28-IC0S (CAR-H); (7) 將慢病毒轉(zhuǎn)移載體 pCDH-EGFR-CD28-IC0S 和 pCDH-ERBB2-CD3 G 轉(zhuǎn)染至 293FT 細(xì) 胞；包裝獲得病毒顆粒，經(jīng)離心濃縮后獲得高滴度的慢病毒懸液； (8) 慢病毒懸液感染T淋巴細(xì)胞從而獲得雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及雙嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞及其制備方法。本發(fā)明構(gòu)建低親和力嵌合抗原受體（chimeric？antigen？receptor，CAR-L）和高親和力的嵌合抗原受體（CAR-H），分別識(shí)別兩種腫瘤相關(guān)抗原，并且分別含有CD3ζ序列和共刺激分子信號(hào)序列(costimulatory？molecule,CM)序列，將它們同時(shí)轉(zhuǎn)染至T淋巴細(xì)胞中，修飾后的T淋巴細(xì)胞只有同時(shí)識(shí)別兩種腫瘤相關(guān)抗原才能被有效激活，增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤的靶向性，降低對(duì)正常組織的損傷。
【IPC分類(lèi)】C12N15/867, A61P35/00, A61K35/17, C12N5/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105087495
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510513931
【發(fā)明人】姜舒, 紀(jì)惜鑾, 張蕓, 羅朝霞
【申請(qǐng)人】深圳市茵冠生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年8月21日