ogens,K. D.Hickey,Ed.,TheAmericanPhytopathologicalSociety, 1986)。施用方法包括單獨(dú)或 周期性地對(duì)植物或植物部分、種皮進(jìn)行含水和不含水噴霧，以及整合入噴霧系統(tǒng)?？商砑尤?制劑的輔助添加劑包括穩(wěn)定劑、改善溶解性能的試劑、濕潤(rùn)劑以及允許微膠囊封裝的試劑。
[0052] 為了特別有效地控制真菌，本發(fā)明的多肽可以和其他殺真菌活性物質(zhì)組合使 用。而且可以與殺菌性、抗病毒性、殺線(xiàn)蟲(chóng)性、殺昆蟲(chóng)性及植物保護(hù)中常用的其他活性物 質(zhì)組合。還可以與肥料、植物激素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合。通過(guò)本發(fā)明的多肽控制真菌的一 種可能是通過(guò)名為轉(zhuǎn)化的方法將編碼所述多肽的多核苷酸序列引入其遺傳物質(zhì)而基因 改造植物。用于制備本發(fā)明該基因改造植物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的（Methods forPlantMolecularBiology,A.ffeissbach,H.ffeissbach,Eds. ,SaundersCollege PubIishing/HarcourtBrace,June1988!Methodsinplantmolecularbiologyand biotechnology，B.R.Glick，J.E.Thompson，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L，1993)。在本發(fā)明 的有利變體中，具有適當(dāng)改造載體的人工基因構(gòu)建體通過(guò)包被DNA的微粒轟擊、所謂的浸 花法或土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化整合入植物、植物部分或植物細(xì)胞中。其他可能的方法包括 例如顯微注射、化學(xué)滲透、電穿孔和與含有DNA的單元例如細(xì)胞、微細(xì)胞、原生質(zhì)體或脂質(zhì) 體的原生質(zhì)體融合。在本發(fā)明另一個(gè)有利的變體中，編碼本發(fā)明多肽的基因經(jīng)合成制備， 其中核苷酸三聯(lián)體（每個(gè)核苷酸三聯(lián)體編碼一個(gè)氨基酸）調(diào)整為基因改造植物優(yōu)選的密 碼子使用。另外，可以根據(jù)已知方法將待轉(zhuǎn)移的外源基因置于可由損傷和生長(zhǎng)素活性活 化的啟動(dòng)子的控制下，由此在真菌寄居后獲得增加的表達(dá)（Rahnamaeian.Insectpeptide metchnikowinconfersonbarleyaselectivecapacityforresistancetofungal ascomycetespathogens.JExpBot. 2009, 60:4105-14)。在本發(fā)明一個(gè)有利的實(shí)施方案中， 谷物和/或馬鈴薯植物經(jīng)基因改造能夠生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
[0053] 對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.1或No. 2的多肽可用于控制真菌。另外，還可以使用由序列截 斷或添加另外的氨基酸殘基所產(chǎn)生的多肽或寡肽。
[0054] 另外，可以使用具有添加的額外序列單元的多肽的變體，例如在重組形式制備中 獲得更高產(chǎn)量或有利于純化。
[0055] 在某些情況下，使用由SEQIDNo.1的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸殘基組成的寡肽可能 是有利的。另外，去除個(gè)別氨基酸殘基，或用不同的氨基酸殘基取代它們可能是有利的。還 可以插入額外的氨基酸殘基。當(dāng)由截短的或延長(zhǎng)的多肽變體出發(fā)時(shí)，也可進(jìn)行所述變化。特 別地，用具有相似理化性質(zhì)的氨基酸殘基取代個(gè)別氨基酸殘基可能是有利的。因此，主要的 氨基酸殘基在以下組內(nèi)可彼此互換：
[0056] 精氨酸和賴(lài)氨酸；
[0057] 谷氨酸和天冬氨酸；
[0058] 谷氨酰胺、天冬酰胺和蘇氨酸；
[0059] 甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸；
[0060] 亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；
[0061] 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；
[0062] 絲氨酸和蘇氨酸。
[0063] 對(duì)來(lái)自SEQIDNo. 1的多肽的鑒定可通過(guò)例如使用已知方法篩選基因組和/ 或cDNA基因文庫(kù)而進(jìn)行，所述方法在例如Sambrook和Russell的關(guān)于分子克隆的書(shū) (SambrookandRussell2001MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpring HarborLaboratoryPress,NJ)中有描述。例如可使用細(xì)菌或菌體作為受體生物制備基 因文庫(kù)。而且所述基因文庫(kù)可以是電子化儲(chǔ)存于適合介質(zhì)的序列數(shù)據(jù)的形式，尤其是若該 數(shù)據(jù)由名為下一代測(cè)序（NextGenerationSequencing)的技術(shù)產(chǎn)生，其無(wú)需對(duì)核酸分子進(jìn) 行分子克隆。對(duì)于篩選用的探針，特別地，可以使用對(duì)應(yīng)于SEQIDNo. 3或SEQIDNo. 4或 其序列片段的互補(bǔ)鏈的核苷酸序列。這些探針的序列可以在遺傳密碼子簡(jiǎn)并性的范圍內(nèi)變 化，并且還可含有例如肌苷（其并非天然存在于編碼蛋白的核酸中）的核苷，以提高氫鍵結(jié) 合的能力。
[0064] 所述篩選還可使用針對(duì)對(duì)應(yīng)于SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2或其序列片段的多肽制 備的抗體進(jìn)行。
[0065] 由于其相對(duì)較小的尺寸，本發(fā)明的多肽可通過(guò)化學(xué)肽合成的方法制備（實(shí)施例 1)。這可以包括使用已知的例如根據(jù)B.Merrifield的固相方法。所述合成可使用Fmoc或Boc保護(hù)基團(tuán)策略手動(dòng)進(jìn)行，或在自動(dòng)肽合成儀的輔助下進(jìn)行?？梢院铣奢^小片段的多肽， 隨后將其連接起來(lái)。
[0066] 本發(fā)明多肽的制備還可通過(guò)在不同的受體生物和受體細(xì)胞中異源表達(dá)適合的 核酸構(gòu)建體而進(jìn)行。所需的基因改造方法在Sambrook和Russell的關(guān)于分子克隆的書(shū) (SambrookandRussell2001MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpring HarborLaboratoryPress,NJ)中有描述。可使用原核系統(tǒng)（例如大腸桿菌或焚光假單胞 菌（Pseudomonasfluorescens))或真核系統(tǒng)（例如昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞）。 [0067] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制備在大腸桿菌中以硫氧還蛋白和六聚組氨酸 序列融合多肽進(jìn)行，其中提供用于切割本發(fā)明多肽的特定蛋白酶識(shí)別序列（實(shí)施例2、3和 4)〇
[0068] 通過(guò)異源表達(dá)獲得的本發(fā)明的多肽可從基因改造的生物或細(xì)胞的細(xì)胞裂解液或 上清液中通過(guò)多種已知方法純化。特別適合的方法包括固定化金屬離子親合色譜、陰離子 交換色譜和反向色譜（實(shí)施例3)。
[0069] 實(shí)施例1:
[0070] 合成制備多肽LserFCPl-77
[0071] 在聚合物載體樹(shù)脂上完全通過(guò)固相合成制備具有SEQIDNo. 1的氨基酸序列的多 肽。通過(guò)反相色譜（柱：AlltechAlltimaC18 4. 6x250mm,FischerScientific)(使用在 水中的漸增甲醇梯度）對(duì)產(chǎn)物的分析產(chǎn)生基本均一的峰，可以預(yù)計(jì)純度至少80% (圖1)。 在通過(guò)電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS)的進(jìn)一步分析過(guò)程中，在m/z746. 50處觀察到優(yōu)勢(shì)分子 離子，其對(duì)應(yīng)于11倍質(zhì)子化的靶分子（圖1)。
[0072] 實(shí)施例2 :
[0073] 在大腸桿菌中構(gòu)建用于重組制備LserFCPl-77和LserFCPl-73的質(zhì)粒
[0074] 為了在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，制備合成基因，其編碼多肽LserFCPl-77的序 列（SEQIDNo. 1)。對(duì)密碼子使用進(jìn)行調(diào)整以適應(yīng)受體生物大腸桿菌K12?；诤贤?，由 EurofinsMffGOperon(Anzingerstr. 7a, 85560Ebersberg,Germany)公司進(jìn)行基因合成。在 編碼序列的5'和3'末端添加能使其插入載體pASK-IBA33plus中的其他序列。因此，完全 合成制備的多核苷酸具有SEQIDNo. 4所示序列。使用兩個(gè)BsaI限制性核酸內(nèi)切酶切割 位點(diǎn)，將合成基因以定向方式插入載體pASK-IBA33plus中。由此獲得的構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化 T0P10和BL21菌株大腸桿菌細(xì)胞。
[0075] 在基于pASK_IBA33plus的構(gòu)建體起始的進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，合成的基因被再克隆 入載體pET_32a(+)。進(jìn)行該再克隆以獲得編碼由硫氧還蛋白、六聚組氨酸序列、蛋白酶識(shí)別 序列和多肽LserFCPl-77組成的融合多肽的質(zhì)粒。制備該質(zhì)粒的兩個(gè)變體，在一個(gè)變體中， 編碼的識(shí)別序列是腸激酶特異性的，在另一個(gè)變體中，編碼的識(shí)別序列是凝結(jié)因子X(jué)a特異 性的。相應(yīng)地，質(zhì)粒被命名為pET-32-FCP-EK和pET-32-FCP-Xa。
[0076] 對(duì)于這些質(zhì)粒的構(gòu)建，合成基因通過(guò)PCR擴(kuò)增，其中使用引物添加插入新載 體所需的額外序列。使用由KpnI限制酶切位點(diǎn)、連接序列、編碼腸激酶識(shí)別序列的序 列以及編碼多肽LserFCPl-77的最初氨基酸殘基的特異性序列組成的正向引物1構(gòu) 建pET-32-FCP-EK。使用由KpnI限制酶切位點(diǎn)、連接序列、編碼因子X(jué)a識(shí)別序列的序 列以及編碼多肽LserFCPl-77的最初氨基酸殘基的特異性序列組成的正向引物2構(gòu)建 pET-32-FCP-Xa。對(duì)于兩種構(gòu)建體，使用由EcoRI限制酶切位點(diǎn)、終止密碼子和編碼多肽 LserFCPl-77的最末氨基酸殘基的特異性序列組成的反向引物3。
[0077] 引物1(正向）：
[0078] 5'-tgaggtaccgacgacgacgacaagcagcatggctatggagcgg-3'
[0079] 引物2(正向）：
[0080] 5'-tgaggtaccggtggtggctccggtattgagggtegccageatggctatggagcgg-3'
[0081]引物3(反向）：
[0082] 5'-tcagaattettaatacccgtgegatttgtag-3'
[0083]PCR產(chǎn)物通過(guò)KpnI和EcoRI限制酶切位點(diǎn)插入載體pET_32a(+)中，獲得的構(gòu)建 體用于BL21(DE3)(Novagen/Merck)菌株大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定通過(guò)在含 有氨芐西林的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上選擇而進(jìn)行。在其基因組DNA中，所用的大腸桿菌菌株含有致 溶菌的A噬菌體，在其上面編碼T7RNA聚合酶的基因受到lacUV5啟動(dòng)子的控制。T7RNA 聚合酶基因的表達(dá)以及在表達(dá)質(zhì)粒上的T7啟動(dòng)子控制下的外源基因的表達(dá)通過(guò)添加異丙 基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG)誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后的不同時(shí)間對(duì)應(yīng)融合多肽的形成通 過(guò)SDSPAGE檢測(cè)，隨后經(jīng)考馬斯藍(lán)染色（圖2)。
[0084] 實(shí)施例3 :
[0085] 在大腸桿菌中產(chǎn)生重組多肽LserFCPl-77
[0086] 用如實(shí)施例2中所述構(gòu)建的質(zhì)粒pET-32-FCP-Xa轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) (Novagen/ Merck)菌株的大腸桿菌細(xì)胞，并在6個(gè)具有擋板的1升的愛(ài)倫美（Erlenmeyer)玻璃瓶中 培養(yǎng)，每個(gè)玻璃瓶含有400mlLB培養(yǎng)基，添加300mg/l氨芐西林，于37°C下以250rpm搖 動(dòng)。在通過(guò)濁度測(cè)定在600nm處觀察到0. 4的吸光值后，通過(guò)添加ImMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。 在持續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)之后，通過(guò)離心收集細(xì)菌細(xì)胞（10,OOOxg，lOmin，4°C)。沉淀重懸于 200ml的緩沖液A(K)OmMNaCl, 30mMTris,pH7.5)，細(xì)胞在高壓勻漿器（Microfluidizer M