110PS,Microfluidics,3OOssipeeRoad，Newton，MA〇2464U.S.A.)中通過剪切力裂解。 離心（70,OOOxg，30min，4°C)后，上清液經(jīng)0. 22mm膜過濾。細胞裂解液以4ml/min的 流速填充于載有Co2+離子的固定化金屬離子親合色譜柱（16x100mm，TALONSuperflow Resin,ClontechLaboratories, 1290TerraBellaAvenue,MountainView,CA94043,IL S.A.)上。所述柱之前用緩沖液A平衡。在填充樣品后，用緩沖液A清洗柱，直至280nm處 的檢測產(chǎn)生恒定值。用緩沖液A中的30mM-100mM的咪唑進行分級梯度洗脫。主要的融合 多肽被IOOmM咪唑洗脫。經(jīng)SDSPAGE伴隨考馬斯藍染色分析，產(chǎn)生高于90%的純度（圖 3) 〇
[0087]通過凝膠滲透色譜（HiPrepDesaltingColumn26/10,GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)在IOmMNaCl，10mMTris，pH7. 5 下對融合多肽進 行再緩沖。10yg融合多肽與500單位的因子Xa(Merck)在10ml切割緩沖液（IOOmM Tris-HCl，20mMNaCl，pH7.5)中室溫孵育16h。反應產(chǎn)物以lml/min的流速填充在用 IOmMTris-HCl，pH8 平衡的強離子交換柱（MonoQ5/50GL,GEHealthcare)上，并用相同 的緩沖液清洗柱。用0-300mMNaCl梯度經(jīng)20分鐘進行洗脫。SDSPAGE分析表明多肽 LserFCPl-77 (其作為切割產(chǎn)物獲得，并在11分鐘洗脫）與剩余多肽組分完全分離（圖4)。 色譜圖中對應的峰僅在UV吸收檢測，而非熒光測量時可見。這可由多肽LserFCPl-77的氨 基酸序列中色氨酸殘基的缺失得到解釋。在SDSPAGE分析中，LserFCPl-77的分子量顯示 明顯的30kDa，而非預期的8. 2kDa。該非典型電泳行為可能歸因于SDS分子與多肽的無效 結合。多肽的確認通過反向色譜（柱：BioBasic8, 2x150mm,Dionex;梯度：10-80%位于 水中的乙腈，含有0.1 %甲酸），直接注入ESI質譜儀（amaZonETD,BrukerDaltonik,Fah renheitstr. 4，D_28359Bremen)進行檢查。在m/z684處觀察到的優(yōu)勢分子離子對應于12 倍質子化的靶分子（圖5)。
[0088] 實施例4 :
[0089] 在大腸桿菌中產(chǎn)生重組多肽LserFCPl-73
[0090] 用如實施例2中所述構建的質粒pET-32-FCP-EK轉化BL21 (DE3) (Novagen/Merck) 菌株的大腸桿菌細胞。細胞的培養(yǎng)和細胞裂解液的處理以類似于實施例3中所述的操作進 行，除了使用〇. 1單位的腸激酶（Novagen)進行融合多肽的切割。在該情況下，也可通過陰 離子交換色譜分離革巴分子（圖6)。然而質譜分析（micrOTOFII，BrukerDaltonik,Fahren heitstr. 4,D-28359Bremen)表明并未形成預期的多肽LserFCPl-77 (圖6)。數(shù)據(jù)清楚地表 明已形成的多肽是具有7755Da分子量的LserFCPl-73。這可以解釋為LserFCPl-77序列最 后四個氨基酸殘基似乎已被腸激酶的非特征活性切掉。
[0091] 實施例5:
[0092] 確定LserFCPl-77抗禾谷鐮刀菌的活性
[0093] 禾谷鐮刀菌（IFA65菌株）
[0094] 供應源：奧地利塔累的農業(yè)生物技術交流部門（InteruniversitaryDepartment forAgriculturalBiotechnologyofTulin,Austria)
[0095] 參考文南犬：Steiner B, Kurz H, Lemmens M, Buerstmayr H. Differential gene expression of related wheat lines with contrasting levels of head blight resistance after Fusarium graminearum inoculation. Theor Appl Genet. 2009Feb； 118(4) :753-64.
[0096] 禾谷鐮刀菌于室溫培養(yǎng)于SNA-瓊脂平板上直至孢子形成。用水將孢子從平板上 掃去，調整至20, 000孢子/ml的密度，于4°C儲存待用。進行測試時，0. 05ml每份的孢子懸 浮液與0. 05ml每份的不同濃度的LserFCPl-77溶液在96-孔微孔板的孔中組合。于室溫 孵育24h后，使用4倍物鏡和10倍放大倍數(shù)，通過顯微鏡檢測孢子萌發(fā)。結果經(jīng)拍照記錄 (圖7)。對萌發(fā)和未萌發(fā)的孢子比例進行計數(shù)，獲得的數(shù)據(jù)用于劑量效應關系圖示（圖8)。 由此證實發(fā)生半峰抑制的濃度為I. 6yM。另外，由萌發(fā)的孢子形成的菌絲長度經(jīng)觀察作為 對抑制的半定量測量（圖7)。
[0097] 實施例6:
[0098] 確定LserFCPl-73抗禾谷鐮刀菌的活性
[0099] 與水對照相比，通過實施例5中所述測試系統(tǒng)確定濃度100yM的LserFCPl-73 的效力。觀察到LserFCPl-73對孢子萌發(fā)的完全抑制（圖9)。
[0100] 實施例7 :
[0101] 確定LserFCPl-77抗寄生疫霉的活性
[0102] 寄生疫霉（分離物329)
[0103]供應源：法國INRA(INRA (institut national de la recherche agronomique))
[0104]參考文獻：Keller H, PamboukdjianN,Ponchet M, Poupet A, Delon R, Verrier JL,Roby D, Ricci P.Pathogen-induced elicitin production in transgenic tobacco generates a hypersensitive response and nonspecific disease resistance. Plant Cell.1999Feb ;11(2):223-35.
[0105] 寄生疫霉于25°C在RyeB瓊脂平板上培養(yǎng)8天。用水洗掉孢子囊，獲得的孢子囊 懸浮液于4°C孵育4h以誘導游動孢子的形成。在RPMI1640培養(yǎng)基中以1:50稀釋后，確定 孢子密度并調整至20, 000孢子/ml。通過實施例5中所述方法進行該測試進一步的操作。 結果也通過拍照記錄（圖10)。
[0106] 序列表
[0107]氨基酸根據(jù)IUPAC命名法縮寫如下：丙氨酸A，精氨酸R，天冬酰胺N，天冬氨酸E， 半胱氨酸C，谷氨酸D，谷氨酰胺Q，甘氨酸G，組氨酸H，異亮氨酸I，亮氨酸L，賴氨酸K， 甲硫氨酸M,苯丙氨酸F,脯氨酸P,絲氨酸S,蘇氨酸T,色氨酸W,酪氨酸Y,纈氨酸V
[0114]SEQIDN0:4-編碼LserFCPl-77的合成基因，其具有適合大腸桿菌的密碼子使用
[0115] 添加的用于克隆的非編碼序列區(qū)段以斜體字母打印。
【主權項】
1. 一種多肽，其包含與SEQ ID No. 2至少12個連續(xù)氨基酸殘基一致的氨基酸序列。2. 根據(jù)權利要求1的多肽，其包含與SEQ ID No. 2的氨基酸序列具有至少65%序列同 源性的氨基酸序列。3. 根據(jù)權利要求1或2的多肽，其在1-1000 y M，尤其是2 y M的濃度下導致禾谷鐮 刀菌孢子萌發(fā)的半峰抑制。4. 根據(jù)權利要求1-3任意一項的多肽，其包含與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2 -致的 氨基酸序列。5. 根據(jù)權利要求1-4至少一項的多肽，其有效對抗鐮刀菌屬和/或疫霉屬生物的生長。6. 根據(jù)權利要求1-5至少一項的多肽，其中N末端被部分或完全的烷化作用或酰化作 用衍生化。7. 根據(jù)權利要求1-6至少一項的多肽，其中C末端被胺化或酯化衍生化。8. 根據(jù)權利要求1-7至少一項的多肽，其中肽鏈被PEG化或羥乙基淀粉化衍生化。9. 根據(jù)權利要求1-8至少一項的多肽，其具有以下序列 Zi-QHGYGAGGHGQQGYGSQHSSHAPQGGHVVREQGFSGHVHEQQAGHHHEAGHHEQAGHHEQSGQQVHGQGH GYK-Z2， 其中 冗1是多肽的N末端，或多肽的末端氨基衍生物，或具有10個以下任意氨基酸的鏈； 厶是多肽的C末端，或多肽的末端羧基衍生物，或具有10個以下任意氨基酸的鏈。10. 根據(jù)權利要求1-9至少一項的多肽，其中Z 2具有SHGY-Z 3的氨基酸序列，其中Z 3是 多肽的C末端，或多肽的末端羧基衍生物，或具有6個以下任意氨基酸的鏈。11. 根據(jù)權利要求1-10至少一項的多肽，其中多肽具有部分或完全的D-氨基酸，或具 有D-反-倒位肽結構。12. -種多核苷酸，其編碼根據(jù)權利要求1或11的多肽。13. 權利要求1-11至少一項的多肽或編碼該多肽并具有以下序列的多核苷酸用于控 制真菌，尤其是植物致病性真菌、鐮刀菌屬和/或疫霉屬生物、霜霉綱生物的用途，所述序 列與選自以下的寡核苷酸或多核苷酸探針在使用〇. 2xSSC于42°C清洗的嚴格條件下雜交： SEQ ID No. 3第1-231核苷酸殘基的互補鏈； SEQ ID No. 3第1-102核苷酸殘基的互補鏈； SEQ ID No. 3第103-331核苷酸殘基的互補鏈； SEQ ID No. 4第18-251核苷酸殘基的互補鏈； SEQ ID No. 4第18-119核苷酸殘基的互補鏈； SEQ ID No. 4第120-251核苷酸殘基的互補鏈。14. 一種方法，用于制備權利要求1-11至少一項的多肽。15. -種除絲光綠蠅野生型細胞之外的細胞，其中所述細胞含有表達權利要求1或2的 多肽或具有SEQ ID No. 1或2的多肽的核酸。16. -種轉基因作物，其含有權利要求15的細胞。
【專利摘要】本發(fā)明公開了包含與SEQ？ID？No.2至少12個連續(xù)氨基酸殘基一致的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多肽能有效抗真菌，尤其是抗植物致病性真菌，并抗寄居于農產(chǎn)品的真菌。本發(fā)明還公開了制備該多肽的方法，以及編碼該多肽的核酸。另外，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的多肽處理植物的方法和制品，還涉及本發(fā)明的核酸用于產(chǎn)生免受真菌損傷的作物的用途。
【IPC分類】C07K14/435, C12N15/82
【公開號】CN105102476
【申請?zhí)枴緾N201480007267
【發(fā)明人】安德里亞斯·維爾森斯卡, 安妮凱思琳·波佩爾, 約亨·威斯納
【申請人】弗勞恩霍夫應用研究促進協(xié)會
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年1月23日
【公告號】EP2956474A1, WO2014124786A1