p〈0. 02)、磷酸膽堿（PC;p〈0. 01)、促吞噬 素（T;p〈0. 01)或PBS(p〈0. 01)處理的狼瘡小鼠中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平（Treg-CD4+、CD25+、 F0XP3+)的FACS分析。
[0050]圖13A-13D示出了在經(jīng)歷DSS誘導(dǎo)炎性腸?。?IBD小鼠"）、隨后用PC-促吞噬 素（空心圓形）和PBS(實(shí)心圓形）處理的小鼠中隨時(shí)間的進(jìn)展作為每日疾病活動(dòng)（DAI; A;p〈0. 02)、直腸出血（B;p〈0. 001)、體重?fù)p失（相對(duì)于t= 0;C;p〈0. 001)和存活（D)的函 數(shù)。
[0051] 圖14A-14B示出了在用PC-促吞噬素（TPC)或PBS處理后的IBD小鼠中的結(jié)腸 (A)和結(jié)腸長(zhǎng)度分析（B;p〈0. 02)。
[0052] 圖15A-15G示出了與來(lái)自未經(jīng)歷DSS誘導(dǎo)IBD(C、G)的小鼠的結(jié)腸切片相比，用 PBS(對(duì)照；A、E)或PC-促吞噬素（B、F)處理的IBD小鼠的H&E染色的結(jié)腸切片。
[0053] 發(fā)明詳述
[0054] 本發(fā)明提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括疫苗組合物，所述疫苗組合物包 含至少一種磷酸膽堿（PC)-綴合物。根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物組合物顯示免疫調(diào) 節(jié)活性。根據(jù)一些實(shí)施方案，藥物組合物用于治療、改善自身免疫性疾病的進(jìn)展，以及防止 自身免疫性疾病的發(fā)作。根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的PC-綴合物被合成產(chǎn)生，以確保這些 化合物的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，同時(shí)保持或甚至增強(qiáng)它們的活性。根據(jù)一些實(shí)施方案，PC-綴合 物可用作針對(duì)Th2表型的受試者的免疫系統(tǒng)的刺激物。
[0055] 如本文所用的，提及本發(fā)明的PC-綴合物，術(shù)語(yǔ)"免疫調(diào)節(jié)"、"免疫調(diào)節(jié)活性 (immunomodulationactivity) 免疫調(diào)節(jié)活性（immunomodulatoryactivity) '，或"調(diào)節(jié) 免疫應(yīng)答"是指，綴合物引發(fā)以下的至少一種的能力：減少淋巴細(xì)胞（B-淋巴細(xì)胞和T-淋 巴細(xì)胞兩者）響應(yīng)于抗原增殖的能力；誘導(dǎo)T和/或B調(diào)節(jié)（抑制）細(xì)胞的產(chǎn)生；和影響 巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。影響巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的功能包括但不限于，刺激凋亡細(xì)胞 的清除和誘導(dǎo)耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞；抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子諸如IL-12、TNF-a和 IL-6的能力；調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟以優(yōu)先引發(fā)Th2樣應(yīng)答；和誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因 子IL-10和以Th2/抗炎方向偏置抗體應(yīng)答。PC-綴合物的免疫調(diào)節(jié)活性在本文中還可稱為 "抗炎"活性。
[0056] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"磷酸膽堿（PC)_綴合物"，是指任選地經(jīng)由間隔物連接至載 體的磷酸膽堿部分。結(jié)構(gòu)元件磷酸膽堿可包括磷酸膽堿的衍生物。載體可以是肽、多肽、單 糖、寡糖、多糖、糖蛋白、脂質(zhì)、聚合物等。每個(gè)可能性是本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0057] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"磷酸膽堿的衍生物"除了其他的以外包括但不限于以下： 氨基苯基磷酸膽堿、4_重氮基苯基磷酸膽堿（4-diazoniophenylphosphorylcholi ne)、4-硝基苯基磷酸膽堿和12-(3-碘苯基）十二烷基磷酸膽堿（12-(3-I〇d〇phenyl)dodecylphosphocholine)。每個(gè)可能性是本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0058] 載體可以是免疫原性的或無(wú)免疫原性。
[0059] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"免疫原性載體"是指能夠誘導(dǎo)針對(duì)PC分子的免疫應(yīng)答的各 種分子或物質(zhì)。
[0060] 根據(jù)其他實(shí)施方案，載體是糖蛋白或免疫原性聚合物分子。PC被不同范圍的生 物體表達(dá)。在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumonia)中，PC被直接 附接至糖殘基，通常認(rèn)為是N-乙?；肴樘前贰＿€已在寬范圍的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括 梭菌屬（Clostridium)、乳球菌屬（Lactococcus)、芽抱桿菌屬（Bacillus)和革蘭氏陰 性細(xì)菌流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae)中檢測(cè)到PC。其中已檢測(cè)到PC的真 核生物體包括許多重要的致病原（disease-causingagent)，諸如原生動(dòng)物利什曼原蟲 (Leishmaniamajor)和克氏維蟲（Trypanosomacruzi);寬范圍的真菌；吸蟲類曼氏血吸 蟲（Schistosomamansoni);絳蟲闊節(jié)裂頭絳蟲（Diphyllobothriumlatum);-些胃腸道 線蟲和所有物種絲蟲線蟲。在人類中，PC出現(xiàn)在細(xì)胞膜的內(nèi)小葉上，并且由凋亡細(xì)胞暴露 于免疫系統(tǒng)。
[0061] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"非免疫原性載體"是指不引起免疫應(yīng)答的各種分子或物質(zhì)。
[0062] 根據(jù)一些實(shí)施方案，PC-綴合物選自由以下組成的組：PC_促吞噬素和PC-聚糖。
[0063] 根據(jù)其他實(shí)施方案，PC-綴合物是PC-促吞噬素。
[0064] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"促吞噬素"是指四肽（蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸-精氨酸， TKPR;SEQIDNO: 17)。促吞噬素可化學(xué)合成或從脾臟由IgG重鏈的Fc結(jié)構(gòu)域的酶裂解分 離。已知促吞噬肽的吞噬刺激活性和體外和體內(nèi)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞的能力。根據(jù)一 些實(shí)施方案，促吞噬素可被認(rèn)為是佐劑。應(yīng)當(dāng)理解，促吞噬素是指促吞噬素及其衍生物，除 了其他的以外包括但不限于以下：蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸TKP;TKPXaa;SEQIDNO: 18)、 蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸-脯氨酸-精氨酸（TKPPR;SEQIDNO: 19)、絲氨酸-賴氨酸-脯 氨酸-精氨酸（SKPR;SEQIDNO:20)、蘇氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸（TRPR;SEQIDNO: 21)和絲氨酸-賴氨酸-脯氨酸-賴氨酸（SKPK;SEQIDNO:22)。每個(gè)可能性是本發(fā)明的 單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0065] 根據(jù)一些實(shí)施方案，PC-綴合物為PC-聚糖。
[0066] 根據(jù)一些實(shí)施方案，術(shù)語(yǔ)"聚糖"是指N型聚糖和0-型聚糖。每個(gè)可能性是本發(fā) 明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0067] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"N-型聚糖"和"N-聚糖"是可互換的，并且是指通過(guò)N-糖苷 鍵共價(jià)鍵合至物質(zhì)（substrate)，諸如PC的聚糖。任何類型的N-聚糖可用于形成本發(fā)明的PC-綴合物。
[0068] 根據(jù)一些實(shí)施方案，將PC綴合至N型聚糖，所述N型聚糖除了其他的以外是N-乙 酰葡糖胺扣1〇嫩(：）和6&1|3 1-4的(3€[1-3]61(^(3。每個(gè)可能性是本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方 案。
[0069]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"0-型聚糖"和"0-聚糖"是可互換的，并且是指通過(guò)0-糖苷 鍵共價(jià)鍵合至物質(zhì)，諸如PC的聚糖。任何類型的〇-聚糖可用于形成本發(fā)明的PC-綴合物。
[0070] 根據(jù)一些實(shí)施方案，將PC綴合至0型聚糖，所述0型聚糖除了其他的以外是-N-乙 酰半乳糖胺（GalNAc)和a-D-Gal-(1 - 3)_(a-L-Fuc_[l- 2])-D_Gal。每個(gè)可能性是本 發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0071] 根據(jù)一些實(shí)施方案，聚糖除了其他的以外包含選自由以下組成的組的單糖：N_乙 酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、唾液酸、葡萄糖、巖藻糖和甘露糖。每個(gè)可能性是本發(fā) 明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0072] 根據(jù)其他實(shí)施方案，PC-綴合物是PC-聚糖，其還包括ES-62。
[0073] 術(shù)語(yǔ)"ES-62"是指經(jīng)由N型聚糖附接至磷酸膽堿（PC)部分的四聚體糖蛋白 (62kDa亞基）。ES-62由嗤齒類絲蟲線蟲Acanthocheilonemaviteae分泌，并被發(fā)現(xiàn)在人 類絲蟲寄生線蟲包括馬來(lái)絲蟲（Brugiamalayi)和盤尾絲蟲（Onchocercavolvulus)中具 有直系同源物。ES-62作用以偏置免疫應(yīng)答朝向有益于蠕蟲存活和宿主健康兩者的抗炎/ Th2表型。例如，盡管ES-62最初誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生低水平的IL-12和TNFa，暴露于寄生 蟲產(chǎn)物最終使細(xì)胞不能響應(yīng)于經(jīng)典刺激物諸如LPS/IFNy產(chǎn)生這些細(xì)胞因子。該分子能 夠直接與免疫系統(tǒng)的許多細(xì)胞，包括B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞相互作 用。相互作用表現(xiàn)為取決于與Toll樣受體4 (TLR4)產(chǎn)生復(fù)合物，并導(dǎo)致調(diào)節(jié)許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 分子包括MAP激酶、PI-3激酶和NF-KB的活性。
[0074] 寄生性蠕蟲在自身免疫性疾病中的作用的實(shí)例包括，在通過(guò)攝入豬蠕蟲豬鞭蟲 (Trichurissuis)的活卵治療的具有活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的患者中的研究。 在該研究中，疾病在攝入卵后緩解。此外，采用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性模型，疾病活動(dòng)性的改 善通過(guò)蠕蟲或蠕蟲衍生物施用來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，用非肥胖糖尿病（NOD)小鼠的研究表明，使 用卵抗原或懦蟲抗原以方定毛蟲（Trichinellaspiralis)、Heligmosomoidespolygyrus、 或曼氏血吸蟲的接種顯著減少試驗(yàn)性I型糖尿?。═lDM)的比率并且抑制胰腺的胰島中 的淋巴樣浸潤(rùn)。此外，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)的改善在蠕蟲治療后實(shí)現(xiàn)；血 吸蟲（Schistosome)懦蟲感染預(yù)防結(jié)腸炎，改變免疫應(yīng)答朝向Th2表型；且Syphacia oblevata感染的大鼠比未感染的大鼠發(fā)展較不嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。線蟲豬蛔蟲、曼氏血吸蟲和 Acanthocheilonemaviteae的提取物也被發(fā)現(xiàn)降低小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA)的嚴(yán) 重程度。
[0075] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明提供了磷酸膽堿（PC)-綴合物，所述磷酸膽堿綴合物 包含連接至選自由以下組成的組的至少一種載體的至少一個(gè)磷酸膽堿部分或其衍生物： 肽、多肽、脂質(zhì)、多糖、單糖、寡糖和聚合物。每個(gè)可能性是本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0076] 根據(jù)一些實(shí)施方案，磷酸膽堿綴合物包含連接至載體的一個(gè)PC部分或其衍生物。
[0077] 根據(jù)其他實(shí)施方案，磷酸膽堿綴合物包含連接至載體的多個(gè)PC部分或其衍生物。
[0078] 根據(jù)其他實(shí)施方案，磷酸膽堿綴合物包含連接至單個(gè)PC部分或其衍生物的多個(gè) 載體。
[0079] 根據(jù)一些實(shí)施方案，磷酸膽堿綴合物由至少一個(gè)PC部分或其衍生物和選自由以 下組成的組的至少一種載體組成：?jiǎn)翁恰⒐烟?、多糖、肽和脂質(zhì)。每個(gè)可能性是本發(fā)明的單獨(dú) 的實(shí)施方案。
[0080] 根據(jù)另外的實(shí)施方案，磷酸膽堿部分或其衍生物和載體被間隔物所分離。
[0081] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"間隔物"，是指載體和PC部分之間的連接或以其他方式橋接 元件，所述元件通常通過(guò)化學(xué)方法或生物學(xué)方法與其連接。間隔物的非限制性實(shí)例除了其 他的以外包括：氨基酸、肽、多肽、蛋白、烴類和聚合物。每個(gè)可能性是本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施 方案。
[0082] 根據(jù)一些實(shí)施方案，PC-綴合物包含彼此連接的PC和載體。
[0083] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"連接"除了其他的以外是指附接、連接、鍵合至、締合以及偶 聯(lián)至。
[0084] 根據(jù)一些實(shí)施方案，PC和載體通過(guò)共價(jià)鍵連接。
[0085] 根據(jù)另外的實(shí)施方案，本發(fā)明的合成PC-綴合物可如下文的實(shí)施例部分所描述的 被合成。
[0086] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明提供了藥物組合物，所