據(jù)以下兩個(gè)方案進(jìn)行用本發(fā)明的PC-綴合物處理關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型：（1)預(yù)防性 的（預(yù)防性）方案，用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA)小鼠，其中在通過(guò)注射膠原II誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎 之前兩天施用PC-綴合物；在八周齡時(shí)施用PC-綴合物，然后檢測(cè)關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)；（2) 治療性方案，其中當(dāng)疾病在進(jìn)展?fàn)顟B(tài)時(shí)（例如，20周齡時(shí)CIA，其與24周齡時(shí)狼瘡相似）施 用PC-綴合物。
[0177] 雄性DBA/1小鼠在尾的基部接受50yg的雞II型膠原（CII)與弗氏完全佐劑以 1:1的乳劑。小鼠由兩個(gè)盲觀察者每周三次評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎的跡象。評(píng)價(jià)是基于以下的嚴(yán)重程 度評(píng)分：〇=正常，1 =紅斑，2 =紅斑加腫脹，3 =功能的延遲/損失，以及總評(píng)分=四肢的 總和。對(duì)于預(yù)防性方案，小鼠在-2天、0天和第21天時(shí)用每只小鼠3yg/0.Iml的PC-綴合 物皮下處理。對(duì)于治療性研究，小鼠在CIA是臨床上可檢測(cè)的1天后開(kāi)始每周三次用PC-綴 合物、3yg/0.ImlPBS皮下處理14天。對(duì)照小鼠在與對(duì)PC-綴合物使用的那些相似的時(shí)間 點(diǎn)接受載體（PBS)或單獨(dú)的部分（例如促吞噬素、聚合物2-甲基丙烯酰氧乙基和聚糖）。
[0178] 增殖評(píng)價(jià)如下：引流淋巴結(jié)細(xì)胞（DLN)和脾細(xì)胞以2xl06/ml在RPMI-1640培養(yǎng)基 中培養(yǎng)96小時(shí)，該RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%熱滅活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、ImM丙 酮酸鈉、〇.ImM非必需氨基酸、l〇〇U/ml青霉素、lOOyg/ml鏈霉素和50yM2-ME。細(xì)胞用羧 基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE)標(biāo)記并與或不與膠原11(50iig/ml)共培養(yǎng)5天。然后，收 獲淋巴細(xì)胞，增殖通過(guò)CFSE稀釋法和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)，并表示為MFI(平均熒光強(qiáng)度）。
[0179] 細(xì)胞因子的譜評(píng)價(jià)如下：脾細(xì)胞和DLN細(xì)胞的培養(yǎng)液在分別暴露于膠 原II(50yg/ml)或刀豆蛋白A(Con-A;5yg/ml) 48小時(shí)和72小時(shí)后收獲并存儲(chǔ)在 約-80°C。PC-綴合物的作用通過(guò)以下Thl/Th2/Thl7選擇的細(xì)胞因子來(lái)檢查。具體地， 促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子（11-1、幾-2、正1^、幾-4、11-10、11-15、幾-17和了陬€〇 的水平使用MILLIPLEXMP小鼠細(xì)胞因子試劑盒（Mi11ipore)根據(jù)制造商的說(shuō)明在 Luminex(Bio-plex? )上進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通過(guò)ELISA試劑盒監(jiān)測(cè)TGFP水平。
[0180] 基于該細(xì)胞因子譜，選擇的細(xì)胞因子被選擇用于使用定量實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)量mRNA 水平，如實(shí)施例4中詳細(xì)描述的。cDNA樣品使用特異性引物（表1)來(lái)擴(kuò)增。
[0181] 血液中自身抗體表達(dá)水平如下評(píng)價(jià)：在不同時(shí)間點(diǎn)從不同組的小鼠采集血液，并 通過(guò)ELISA追蹤血清中抗膠原II和抗PC的滴度。簡(jiǎn)言之，用PBS中的膠原-II(10yg/ 1111)、？01(1^(1〇118/1111)、聚糖（1〇118/1111)、促吞卩策素（1〇118/1111)或2甲基丙稀酰氧乙基聚 合物（l〇yg/ml)包被ELISA板，4°C下過(guò)夜。然后，將BSA(在PBS中3% )封閉的板在室 溫下暴露于不同稀釋度的血清（1:200至1:10, 000)持續(xù)2小時(shí)。結(jié)合用綴合至堿性磷酸 酶的抗小鼠IgG或IgM和適當(dāng)?shù)牡孜飦?lái)探測(cè)。數(shù)據(jù)在405nM參考（ref.) 600nM處讀取。抗CCP(環(huán)瓜氨酸肽）抗體滴度使用抗DIASTAT抗CCP2按照制造商的說(shuō)明并具有以下修改來(lái) 確定：小鼠血清以樣品稀釋液稀釋至1:10或1:100,且第二抗體被堿性磷酸酶綴合的山羊 抗小鼠IgG代替。
[0182] 小鼠爪子的組織病理學(xué)也如下被評(píng)價(jià)：小鼠爪子被固定在4%中性緩沖的福 爾馬林（Sigma)中，脫鈣，切片，并用H&E或核固寶紅-苯胺藍(lán)-橙G(NuclearFast Rubine-AnilineBlue-OrangeG)染色。間隔80ym的四個(gè)冠狀切片由兩個(gè)獨(dú)立的觀察員 評(píng)分，對(duì)于細(xì)胞浸潤(rùn)、滲出、和血管翳以低倍（lowerpower)，且對(duì)于骨侵蝕和軟骨破壞以低 倍（610)和高倍（highpower) (6100)。使用如下的從0至3的半定量分級(jí)量表：0,無(wú)變化； 1，輕度變化；2,中度變化；和3,在實(shí)驗(yàn)中觀察到的最嚴(yán)重的變化。軟骨破壞被確定為軟骨 相對(duì)于總軟骨面積的損失。每個(gè)動(dòng)物的平均評(píng)分以各自參數(shù)來(lái)確定，并且評(píng)分被平均以確 定組平均數(shù)。
[0183] 調(diào)節(jié)性T評(píng)價(jià)如下進(jìn)行：CD4+⑶25+Treg可在蠕蟲(chóng)感染期間被誘導(dǎo)。來(lái)自其中CIA 進(jìn)展在用PC-綴合物處理后減弱的小鼠的脾細(xì)胞和DLN細(xì)胞被進(jìn)一步分析Thl/Th2/Thl7 細(xì)胞因子產(chǎn)生和CD4+CD25+Foxp3+，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)表型。Treg水平的測(cè)量使用磁珠陰 性選擇⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒通過(guò)FACS來(lái)進(jìn)行。試劑盒包含針對(duì)⑶8 (Ly-2)、 CDllb(Mac-I)、CD45R(B220)、CD49b(DX5)、Ter-119的譜系特異性生物素綴合的抗體的混合 物，和用于消耗非CD4+T細(xì)胞的抗生物素微珠，以及用于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的隨后陽(yáng) 性選擇的⑶25-PE和抗PE微珠。細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。Foxp3的mRNA水平也通過(guò)實(shí) 時(shí)RT-PCR如以上對(duì)細(xì)胞因子描述的來(lái)分析。使用的引物除了其他的以外包括在以上表1 中所列的那些。
[0184] 具體實(shí)施方案的以上描述將非常如此充分地揭示本發(fā)明的一般性質(zhì)，以至于其他 人無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)便可通過(guò)應(yīng)用現(xiàn)有知識(shí)，為了各種應(yīng)用容易地修改和/或調(diào)整此類具體實(shí) 施方案且不偏離一般概念，并因此，此類調(diào)整和修改應(yīng)該并意圖被包含在所公開(kāi)的實(shí)施方 案的等同物的含義和范圍內(nèi)。應(yīng)理解，本文所采用的措辭或術(shù)語(yǔ)是為了描述性目的而非限 制性目的。用于實(shí)施各種公開(kāi)的功能的方法、材料和步驟可采取多種替代性形式而不偏離 本發(fā)明。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種磷酸膽堿綴合物，所述磷酸膽堿綴合物包含至少一個(gè)磷酸膽堿部分或其衍生物 和選自由以下組成的組的至少一種載體：?jiǎn)翁恰⒐烟?、糖蛋白、多糖、肽和脂質(zhì)。2. 如權(quán)利要求1所述的磷酸膽堿綴合物，其中所述至少一種載體選自促吞噬素和聚 糖。3. 如權(quán)利要求1所述的磷酸膽堿綴合物，其中所述至少一種載體是聚糖。4. 如權(quán)利要求3所述的磷酸膽堿綴合物，其中所述聚糖是N型聚糖，所述N型聚糖包括 N-乙酰葡糖胺和Gal P 1-4 [Fuc a 1-3]GlcNAc的至少一種。5. 如權(quán)利要求3所述的磷酸膽堿綴合物，所述磷酸膽堿綴合物還包括ES-62。6. 如權(quán)利要求1所述的磷酸膽堿綴合物，其中所述至少一種載體是促吞噬素。7. 如權(quán)利要求1所述的磷酸膽堿綴合物，所述磷酸膽堿綴合物包含連接至所述至少一 種載體的一個(gè)磷酸膽堿部分或其衍生物。8. 如權(quán)利要求1所述的磷酸膽堿綴合物，所述磷酸膽堿綴合物包含連接至所述至少一 種載體的多個(gè)磷酸膽堿部分或其衍生物。9. 如權(quán)利要求1所述的磷酸膽堿綴合物，所述磷酸膽堿綴合物包含連接至磷酸膽堿部 分或其衍生物的多個(gè)載體。10. 如權(quán)利要求1所述的磷酸膽堿綴合物，其中所述磷酸膽堿部分或其衍生物和所述 至少一種載體被間隔物所分離。11. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含磷酸膽堿綴合物，所述磷酸膽堿綴合物包含 連接至選自促吞噬素和聚糖的至少一種載體的至少一個(gè)磷酸膽堿部分或其衍生物，并且所 述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。12. 如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，所述藥物組合物是疫苗。13. 如權(quán)利要求12所述的疫苗，所述疫苗還包含佐劑。14. 如權(quán)利要求13所述的疫苗，其中所述佐劑選自由以下組成的組：油包水乳劑、水包 油乳劑和脂質(zhì)體。15. -種用于治療需要其的受試者中自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受 試者施用疫苗組合物，所述疫苗組合物包含磷酸膽堿綴合物，所述磷酸膽堿綴合物包含至 少一個(gè)磷酸膽堿部分或其衍生物和選自由以下組成的組的至少一種載體：聚合物、單糖、寡 糖、多糖、肽、多肽和脂質(zhì)。16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中治療包括以下的至少一種：預(yù)防所述自身免疫性 疾病的發(fā)作、減弱所述自身免疫性疾病的進(jìn)展和抑制所述自身免疫性疾病的進(jìn)展。17. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受試者具有發(fā)展所述自身免疫性疾病的高風(fēng) 險(xiǎn)。18. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述自身免疫性疾病與異常炎癥相關(guān)。19. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述自身免疫性疾病選自由以下組成的組：類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、多發(fā)性硬化、尋常型天皰瘡、抗磷脂綜合征、銀肩病、自身免疫性肝炎、結(jié) 節(jié)病、炎性腸病、結(jié)腸炎、克羅恩病和慢性阻塞性肺疾病。20. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述疫苗組合物以選自由以下組成的組的施用途 徑施用：靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、口服、舌下、粘膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻、皮下、局部、皮內(nèi)或經(jīng)皮。21. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述受試者是人類。23. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是狼瘡。24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述載體選自由以下組成的組：卵清蛋白、促吞噬 素和2-甲基丙烯酰氧乙基。25. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述磷酸膽堿綴合物包括磷酸膽堿-促吞噬素、磷 酸膽堿-卵清蛋白和2-甲基丙烯酰氧乙基-磷酸膽堿的至少一種。26. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是結(jié)腸炎。27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述載體是促吞噬素。28. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述磷酸膽堿綴合物是磷酸膽堿-促吞噬素。29. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述載體選自由以下組成的組：促吞噬素、聚糖和 2-甲基丙烯酰氧乙基。31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述PC-綴合物包括磷酸膽堿-促吞噬素、磷酸膽 堿-聚糖和2-甲基丙烯酰氧乙基-磷酸膽堿的至少一種。32. 疫苗組合物用于治療自身免疫性疾病的用途，所述疫苗組合物包含磷酸膽堿綴合 物，所述磷酸膽堿綴合物包含至少一個(gè)磷酸膽堿部分或其衍生物和選自由以下組成的組的 至少一種載體：聚合物、單糖、寡糖、多糖、肽、多肽和脂質(zhì)。33. -種用于治療自身免疫性疾病的試劑盒，所述試劑盒包含疫苗組合物，所述疫苗組 合物包含磷酸膽堿綴合物，所述磷酸膽堿綴合物包含至少一個(gè)磷酸膽堿部分或其衍生物和 選自由以下組成的組的至少一種載體：聚合物、單糖、寡糖、多糖、肽、多肽和脂質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療自身免疫性疾病的磷酸膽堿(PC)-綴合物和包含磷酸膽堿(PC)-綴合物的藥物組合物，特別是疫苗。特別地，本發(fā)明的PC-綴合物有效預(yù)防或治療與病理性炎癥相關(guān)的自身免疫性疾病。
【IPC分類】C07H3/06, A61K31/66, C07F9/02, C07K19/00, A61P37/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105102485
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480020199
【發(fā)明人】耶胡達(dá)·休恩菲爾德, 米麗亞姆·布蘭克
【申請(qǐng)人】堤樂(lè)哈修門(mén)醫(yī)學(xué)研究基礎(chǔ)建設(shè)及服務(wù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2014年2月5日
【公告號(hào)】EP2953978A1, WO2014122646A1