一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶解制備抗氧化肽領域，特別涉及一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法。
【背景技術】
[0002]自由基可以造成機體的多種損傷及病變，加速機體的衰老；抗氧化劑可以清除體內(nèi)多余的自由基，增加機體免疫力，延緩衰老，從而實現(xiàn)機體的自我保護。將蛋白質(zhì)通過酶解制備成抗氧化活性肽是目前食品及藥品科學界的研究熱點，抗氧化肽具有清除機體內(nèi)自由基，減輕機體所受氧化損傷及抗衰老的作用。國內(nèi)外的科學工作者以各種動植物蛋白質(zhì)為原料，通過酶解法制備抗氧化肽多有報道。
[0003]然而另一方面，由于開發(fā)技術的局限和人為的忽略，導致我國有很多優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源沒有得到很好地綜合開發(fā)利用，而遭到浪費，并造成嚴重的環(huán)境污染。比如近年來由于鰓出血病的影響，江蘇沿海養(yǎng)殖的異育銀鯽出現(xiàn)大量的死亡，只2014年全年損失接近10億元人民幣，而死亡的魚富含豐富的蛋白質(zhì)資源，經(jīng)過特殊處理后，再經(jīng)過特定蛋白酶的酶解，可以制成抗氧化肽粉再生利用，并創(chuàng)造一定的經(jīng)濟效益。但沿海當?shù)貙τ邛w出血死亡的病魚多采取粗礦的處理方法，比如，掩埋或焚燒；這不僅造成蛋白質(zhì)資源的大量浪費，而且造成環(huán)境的污染，影響當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，該方法利用發(fā)病異育銀鯽制備具有高活性的抗氧化肽粉，不僅可以解決發(fā)病異育銀鯽蛋白質(zhì)資源浪費及環(huán)境污染問題，而且可以變廢為寶減少養(yǎng)殖戶的損失，具有良好的應用前景。
[0005]本發(fā)明的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，包括:
[0006](I)將發(fā)病異育銀鯽去魚頭、魚鱗、魚皮及內(nèi)臟，并將剩余的魚身部分切段；將得到的魚段在室溫下于紫外燈下照射20-30min，以初步滅活病毒及細菌；
[0007](2)將初步滅活病毒及細菌的魚段按質(zhì)量體積比1:20?30置于正丁醇中，于4?8°C下不斷攪拌對魚段進行脫脂24?32h，沖洗干凈，最后用純水浸泡；
[0008](3)按質(zhì)量體積比Ig: 3?5ml向魚段中加入水，調(diào)節(jié)pH至7.0?8.0，并按魚段質(zhì)量的I?2%加入風味蛋白酶，加熱至40?60°C，在攪拌的條件下酶解l_2h ;隨后調(diào)節(jié)酶解液pH至6.5?7.0，并按魚段質(zhì)量的0.5?I %加入菠蘿蛋白酶，加熱至45?50°C，在攪拌的條件下酶解l_2h ;
[0009](4)酶解完畢后于沸水浴中煮15-20min滅活蛋白酶及進一步滅活病毒和細菌，離心，收集上清液；
[0010](5)于冰水浴條件下向步驟⑷的上清液中緩慢加入研磨細碎的硫酸銨至飽和度為85?88%，攪拌待硫酸銨溶解完全后，置于4?6°C過夜鹽析；
[0011](6)鹽析后離心，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液復溶，得到復溶液；按體積向復溶液中加入0.5?1%的活性炭，于35?40°C下攪拌脫腥，離心，收集上清液；
[0012](7)用截留分子量不同的超濾板于4?6°C下將步驟(5)的上清液分成#>10kDa、10kDa>#>5kDa、5kDa>#>3kDa和#>3kDa四段；將各段上清液于4?6°C透析脫鹽，旋蒸濃縮，最后冷凍干燥制得不同分子量段抗氧化肽粉。
[0013]所述步驟(I)中的魚身部分切成2-3cm段。
[0014]所述步驟(2)中的正丁醇濃度為10%。
[0015]所述步驟(2)中的脫脂每Sh更換一次液體。
[0016]所述步驟(4)中的離心具體為:于4°C 10000r/min條件下離心20min。
[0017]所述步驟(6)中的鹽析后離心具體為:于4°C 8000r/min條件下離心1min ;脫腥后離心具體為:于室溫5000r/min條件下離心1min。
[0018]所述步驟(6)中的磷酸鹽緩沖液pH7.0，含0.15M氯化鈉。
[0019]所述步驟(7)中的透析脫鹽每12h更換一次透析液。
[0020]所述步驟(7)中的旋蒸濃縮溫度為50°C。
[0021]本發(fā)明以發(fā)病異育銀鯽為原料，以DPPH自由基清除率為抗氧化活性評價指標的不同分子量段抗氧化肽粉的制備。
[0022]有益效果
[0023]本發(fā)明利用發(fā)病異育銀鯽制備具有高活性的抗氧化肽粉，不僅可以解決發(fā)病異育銀鯽蛋白質(zhì)資源浪費及環(huán)境污染問題，而且可以變廢為寶減少養(yǎng)殖戶的損失，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0024]圖1為實施例1的技術路線圖；
[0025]圖2為各酶酶解液的DPPH清除率；
[0026]圖3為不同硫酸銨的飽和度鹽析效果；
[0027]圖4為1.0mg/mL不同分子量段抗氧化肽粉的DPPH清除效果。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0029]實施例1
[0030](I)將10條發(fā)病異育銀鯽去魚頭、魚鱗、魚皮及內(nèi)臟，并將剩余的魚身部分切成2_3cm 段；
[0031](2)將切段的魚身在室溫(25°C左右)下于紫外燈下照射20min，以初步滅活病毒及細菌；
[0032](3)將初步滅活病毒及細菌的魚段按質(zhì)量體積比1:20置于10%正丁醇中，于4°C下不斷攪拌對魚段進行脫脂24h，期間每Sh更換一次液體，再用自來水沖洗干凈，最后用純水浸泡一次；
[0033](4)按質(zhì)量體積比lg:3ml向魚段中加入水，調(diào)節(jié)pH至7.0 (酶解期間不斷調(diào)整，保證pH值在此范圍內(nèi))，并按魚段質(zhì)量的1%加入風味蛋白酶，加熱至50°C，在攪拌的條件下酶解Ih ；
[0034](5)將(4)中酶解液調(diào)節(jié)pH至6.5 (酶解期間不斷調(diào)整，保證pH值在此范圍內(nèi))，并按魚段質(zhì)量的0.5%加入菠蘿蛋白酶，加熱至45°C，在攪拌的條件下酶解Ih ；
[0035](6)將酶解液置于沸水浴中15min，以滅酶及