進(jìn)一步滅活病毒和細(xì)菌；
[0036](7)于4°C 10000r/min條件下離心20min，收集上清液；
[0037](8)于冰水浴條件下向(7)上清液中緩慢加入事先研磨至細(xì)碎的硫酸銨粉末至飽和度為85%，期間用磁力攪拌器不斷攪拌，待硫酸銨溶解完全后，置于4°C過夜鹽析；
[0038](9)于4°C 8000r/min條件下離心lOmin，收集沉淀；
[0039](10)用1mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含0.15M氯化鈉)復(fù)溶(9)中沉淀蛋白質(zhì)；
[0040](11)按體積，向(10)復(fù)溶液中加入0.5%的活性炭，于35°C下，磁力攪拌30min脫腥，于室溫5000r/min條件下離心lOmin，收集上清液；
[0041](12)用截留分子量不同的超濾板于4°C條件下將(11)中的上清液分成#>10kDa，10kDa>#>5kDa、5kDa>#>3kDa 和 #>3kDa 四段；
[0042](13)將各不同分子量段上清液于4°C透析脫鹽48h，期間每12h更換一次透析液，再將各段透析液于50°C條件下旋蒸濃縮，最后冷凍干燥制得不同分子量段的抗氧化肽粉。
[0043]由圖2可以看出在各酶最適條件下，酶解上清液對(duì)DPPH清除率強(qiáng)弱順序?yàn)?風(fēng)味蛋白酶 > 菠蘿蛋白酶 > 胰蛋白酶 > 木瓜蛋白酶 > 堿性蛋白酶 > 胃蛋白酶 > 酸性蛋白酶 > 中性蛋白酶，所以選擇風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶進(jìn)行分步酶解。
[0044]由圖3可以看出，隨著硫酸銨飽和度的增加，上清液中的蛋白質(zhì)濃度逐漸降低即大部分蛋白質(zhì)被鹽析出來，另一方面考慮到硫酸銨的利用率，所以將85%定為硫酸銨鹽析的最終飽和度。
[0045]經(jīng)檢測(cè)，#>10kDa段、10kDa>#>5kDa 段、5kDa>#>3kDa 段和 #>3kDa 段抗氧化肽粉的產(chǎn)率分別為20.9%、14.3%、10.1 %和7.4%;當(dāng)各段濃度為1.0mg/mL時(shí)，其對(duì)應(yīng)的DPPH清除率分別為 43.89%、51.87%、71.03%和 92.43%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，包括: (1)將發(fā)病異育銀鯽去魚頭、魚鱗、魚皮及內(nèi)臟，并將剩余的魚身部分切段；將得到的魚段在室溫下于紫外燈下照射20-30min，以初步滅活病毒及細(xì)菌； (2)將初步滅活病毒及細(xì)菌的魚段按質(zhì)量體積比1:20?30置于正丁醇中，于4?8°C下不斷攪拌對(duì)魚段進(jìn)行脫脂24?32h，沖洗干凈，最后用純水浸泡； (3)按質(zhì)量體積比Ig:3?5ml向魚段中加入水，調(diào)節(jié)pH至7.0?8.0，并按魚段質(zhì)量的I?2%加入風(fēng)味蛋白酶，加熱至40?60°C，在攪拌的條件下酶解l_2h ;隨后調(diào)節(jié)酶解液pH至6.5?7.0，并按魚段質(zhì)量的0.5?I %加入菠蘿蛋白酶，加熱至45?50°C，在攪拌的條件下酶解l_2h ; (4)酶解完畢后于沸水浴中煮15-20min滅活蛋白酶及進(jìn)一步滅活病毒和細(xì)菌，離心，收集上清液； (5)于冰水浴條件下向步驟(4)的上清液中加入研磨細(xì)碎的硫酸銨至飽和度為85?88%，攪拌待硫酸銨溶解完全后，置于4?6°C過夜鹽析； (6)鹽析后離心，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，得到復(fù)溶液；按體積向復(fù)溶液中加入0.5?1%的活性炭，于35?40°C下攪拌脫腥，離心，收集上清液； (7)用截留分子量不同的超濾板于4?6°C下將步驟￠)的上清液分成#>10kDa、10kDa>#>5kDa、5kDa>#>3kDa和#>3kDa四段；將各段上清液于4?6°C透析脫鹽，旋蒸濃縮，最后冷凍干燥制得不同分子量段抗氧化肽粉。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步驟(I)中的魚身部分切成2-3cm段。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的正丁醇濃度為10%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的脫脂每Sh更換一次液體。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步驟(4)中的離心具體為:于4°C 10000r/min條件下離心20min。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步驟(6)中的鹽析后離心具體為:于4°C 8000r/min條件下離心1min ;脫腥后離心具體為:于室溫5000r/min條件下離心lOmin。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步驟(6)中的磷酸鹽緩沖液pH7.0，含0.15M氯化鈉。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步驟(7)中的透析脫鹽每12h更換一次透析液。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，其特征在于:所述步驟(7)中的旋蒸濃縮溫度為50°C。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分步酶解發(fā)病異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽粉的方法，包括：經(jīng)過去除下腳料部位、分段、紫外初步滅活病毒和細(xì)菌、正丁醇脫脂、分步酶解、高溫進(jìn)一步滅活病毒和細(xì)菌、上清液硫酸銨鹽析、緩沖液復(fù)溶、活性炭脫腥、超濾板分段、脫鹽、旋蒸濃縮和冷凍干燥的方法制備得到不同分子量段抗氧化肽粉。本發(fā)明利用發(fā)病異育銀鯽制備具有高活性的抗氧化肽粉，不僅可以解決發(fā)病異育銀鯽蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)及環(huán)境污染問題，而且可以變廢為寶減少養(yǎng)殖戶的損失，具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C07K1/36, C07K1/34, C12P21/06, C07K1/30
【公開號(hào)】CN105112483
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510578691
【發(fā)明人】史文軍, 萬夕和, 王李寶, 沈輝, 凌云, 黎慧, 喬毅, 戚原野, 蔣葛, 范賢平
【申請(qǐng)人】江蘇省海洋水產(chǎn)研究所
【公開日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2015年9月11日