煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，同時還涉及一種煙 草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草青枯病是由青枯假單包桿菌引起的維管束病害，以土壤傳播為主，是威脅煙 草生產(chǎn)的毀滅性病害之一，一旦發(fā)病即可造成全株死亡，對煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量造成極大影 響。在我國長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、福建、臺灣、湖南、江西、廣西東 部、安徽南部、四川及貴州局部煙區(qū)危害嚴(yán)重，個別年份暴發(fā)流行，常與根黑腐病、黑脛病、 根結(jié)線蟲病混合發(fā)生。許多煙田發(fā)病率達(dá)50 %以上，在極端氣候下發(fā)病率可高達(dá)80 %~ 90%，造成毀滅性損失，已成為我國煙草生產(chǎn)及其經(jīng)濟(jì)效益上的重要制約因素。
[0003] 煙草青枯病一旦發(fā)生，防治難度較大，因此需要在發(fā)生前快速、準(zhǔn)確地檢測潛伏在 植煙土壤中青枯病菌的數(shù)量，對控制青枯病菌具有重要意義。
[0004] 目前，對病害的檢測方法主要有常規(guī)測定法、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等， 常規(guī)測定法主要是通過選擇性培養(yǎng)基來分離病菌病根據(jù)形態(tài)進(jìn)行鑒定的方法，其缺點(diǎn)是 檢測周期長，初學(xué)者誤判率高。血清學(xué)技術(shù)檢測微生物病原菌準(zhǔn)確度較高，但是該技術(shù)操 作過程較為復(fù)雜，靈敏度不高。而熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種高通量、高 靈敏度的檢測技術(shù)，在病原微生物的檢測方面應(yīng)用很廣，但目前應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技 術(shù)檢測R.solanacearum的報道較少。2000年Weller等根據(jù)設(shè)計(jì)特異TaqMan探針，通 過實(shí)時熒光定量PCR特異檢測R.solanacearum;2005年漆艷香等根據(jù)香蕉細(xì)菌性枯萎病 菌（R.solanacearumrace2) 16SrDNA序列的高變區(qū)，設(shè)計(jì)引物RsF/RsR和TaqMan探針 Rsprobe，用實(shí)時焚光PCR對R.solanacearumrace2進(jìn)行檢測，其檢測靈敏度為24. 6fg/ yL懸液。
[0005] 鎖核酸（Lockednucleicacid，LNA)是一種寡核酸衍生物，其結(jié)構(gòu)中0-D-咲 喃核糖的2-0, 4-C位通過縮水作用形成環(huán)形的結(jié)構(gòu)如氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基 橋，呋喃糖的結(jié)構(gòu)鎖定在C3內(nèi)型的N構(gòu)型，形成剛性的縮合結(jié)構(gòu)。LNA的這個環(huán)形橋能鎖定 呋喃糖的N構(gòu)型，降低核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，具有較強(qiáng)的 雜交性和穩(wěn)定性。在寡核苷酸中加入鎖（LNA)修飾堿基可顯著增強(qiáng)寡核苷酸與DNA的結(jié)合 能力。
[0006] R. solanacearum是一種嚴(yán)重危害煙草的病原細(xì)菌，Realtime-PCR檢測技術(shù)的研 究將為煙草青枯病的預(yù)防提供重要依據(jù)。但目前的檢測方法靈敏度仍然較低，尤其是針對 土壤中低拷貝的病菌，需要更加敏感的煙草青枯病檢測試劑和檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，其能夠快 速、高敏感度地檢測植煙土壤中青枯病菌的數(shù)量。
[0008] 同時，本發(fā)明還提供一種煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其操作過程 簡單，檢測時間短，敏感度高，安全可靠。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0010] 煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，其包含以下引物：
[0011] 正向引物：5'-TACCGCAICAAAQAGGGCAG-3'（如SEQIDNO. 1 所示），
[0012] 反向引物：5' -CTTCTGSGGTGIGCAATCCT-3'（如SEQIDNO. 2 所示）；
[0013] 其中，下劃線表示LNA修飾位點(diǎn)。
[0014] 具體的，煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒還可以包含2X熒光定量PCR 反應(yīng)混合液、標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品、DNAMarker、超純水等。所述標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品為包含青 枯病菌胞外葡聚糖酶基因（endoglucanase，縮寫EG)片段的DNA。
[0015] 煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟：以待測樣品DNA為模 板，利用正、反向引物進(jìn)行SYBRGreenI熒光定量PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增片段為246bp時，將待測 樣品DNA的CT值代入以青枯病菌拷貝數(shù)對數(shù)值為X軸、CT值為Y軸制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得 至IJPCR反應(yīng)體系中青枯病菌的拷貝數(shù)；將拷貝數(shù)代入以下公式計(jì)算得到單位質(zhì)量待測樣品 中青枯病菌的定殖數(shù)量；
[0016] C = QX (VDNA/VPCR) X (l/ffEXT),
[0017] 式中：C為單位質(zhì)量待測樣品中青枯病菌的定殖數(shù)量；Q為PCR反應(yīng)體系中青枯病 菌的數(shù)量；VDNA/Vrc#待測樣品的稀釋倍數(shù)，其中VDNA為待測樣品稀釋后的總體積，VPeR為加 入PCR反應(yīng)體系中的稀釋后待測樣品的體積；WEXT為待測樣品的質(zhì)量。
[0018] 所述待測樣品可以為煙區(qū)感染青枯病煙株附近土壤。
[0019] 所述正、反向引物如下：
[0020] 正向引物：5' -TACCGCAICAAASAGGGCAG-3 '，
[0021] 反向引物：5' -CTTCTGSGGTGIGCAATCCT-3'（下劃線表示LNA修飾位點(diǎn)）。
[0022] 所述SYBRGreenI熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2X熒光定量PCR反應(yīng)混合 液12. 5yL，待測樣品DNA溶液1yL，10ymol/L正/反向引物各1yL，ddH20補(bǔ)足至25yL。
[0023] 所述SYBRGreenI熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95°C熱啟動，8min預(yù)變性； 擴(kuò)增循環(huán)：95°C30s，60°C10s，72°C20s，循環(huán) 45 次。
[0024] 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法為：
[0025] 1)以標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品為模板，利用正、反向引物（同上）進(jìn)行SYBRGreenI熒光 定量PCR擴(kuò)增，得到大小246bp的擴(kuò)增片段，回收擴(kuò)增片段并將其插入到載體pMD18-T中， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后得到重組質(zhì)粒PMD18T-EG;
[0026]2)將重組質(zhì)粒pMD18T-EG制成逐級稀釋液（即若干濃度梯度液），再利用正、反 向引物進(jìn)行SYBRGreenI熒光定量PCR擴(kuò)增，記錄每級稀釋液的CT值（每級稀釋液均擴(kuò) 增出246bp產(chǎn)物），以每級稀釋液中青枯病菌拷貝數(shù)對數(shù)值為X軸、CT值為Y軸制得標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
[0027] 步驟1)中所述標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品為包含青枯病菌胞外葡聚糖酶基因片段的（質(zhì) 粒）DNA。
[0028] 步驟1)、2)中所述SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2X熒光定 量PCR反應(yīng)混合液12. 5yL，標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品或重組質(zhì)粒pMD18 T-EG逐級稀釋液1yL， 10ymol/L正/反向引物各1yL，ddH20補(bǔ)足至25yL。
[0029] 步驟1)、2)中所述SYBRGreenI熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95°C熱啟動， 8min預(yù)變性；擴(kuò)增循環(huán)：95°C30s，60°C10s，72°C20s，循環(huán) 45 次。
[0030] 步驟1)中所述篩選陽性克隆采用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素在LB培 養(yǎng)基中的濃度為100ng/mL，培養(yǎng)24h后采用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。
[0031] 步驟2)中所述逐級稀釋液的制備方法為：將步驟1)中重組質(zhì)粒pMD18T-EG經(jīng)紫 外分光光度計(jì)A260定量，測量值即為質(zhì)粒母液的質(zhì)量濃度，用滅菌后的超純水稀釋成若干 濃度梯度，即得。
[0032] 本發(fā)明的有益效果：
[0033] 本發(fā)明以青枯病菌EG基因區(qū)域片段為目標(biāo)檢測序列，采用LNA技術(shù)合成覆蓋目標(biāo) 片段的引物序列，結(jié)合熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)，得到一種高靈敏度、高效快速檢測煙草青枯 病菌的熒光定量核酸擴(kuò)增檢測試劑盒。
[0034]與普通引物常規(guī)熒光定量PCR檢測煙草青枯病菌相比，本發(fā)明中鎖核苷酸（LNA) 增敏的煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法適用于植煙土壤青枯病菌 的定量檢測，具有以下優(yōu)勢：高通量，高靈敏度，檢測時間較短，操作過程簡單，對待測樣品 要求較低等。無論是沙質(zhì)土、壤土、紅土還是染病的生長煙株或田間殘留煙體等，均能取得 較準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。
[0035] 本發(fā)明中鎖核苷酸（LNA)增敏的煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢 測方法，相較普通定量PCR技術(shù)更加高效、快速，操作簡單且價格低廉，對環(huán)境中微量青枯 病菌的檢測具有十分重要的意義，將對我國煙草青枯病的防控起到積極作用。
【附圖說明】
[0036]圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中青枯病菌EG基因擴(kuò)增片段的電泳圖；
[0037] 圖2為青枯病菌EG基因擴(kuò)增片段測序結(jié)果；
[0038] 圖3為質(zhì)粒母液逐級稀釋液的擴(kuò)增曲線；
[0039]圖4為以青枯病菌拷貝數(shù)對數(shù)值為X軸、CT值為Y軸建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0040] 圖5為待測土壤樣品DNA溶液的擴(kuò)增曲線；
[0041] 圖6為待測土壤樣品DNA溶液的溶解曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 本實(shí)施例中煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒包含以下引物：
[0045]正向引物：5 '-TACCGCAICAAASAGGGCAG-3'，
[0046] 反向引物：5'-CTTCTGSGGTGIGCAATCCT-3'（下劃線表示LNA修飾位點(diǎn)）。
[0047] 實(shí)施例2
[0048] 本實(shí)施例中煙草青枯病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，包含：2X熒光定量 PCR反應(yīng)混合液20mL，標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品（包含青枯病菌胞外葡聚糖酶基因片