段）5mL， lOymol/L正/反向引物各5mL，ddH20 50mL，DNAMarker，以及以下引物：
[0049]正向引物：5 '-TACCGCAICAAA￡AGGGCAG-3'，
[0050] 反向引物：5'-CTTCTGSGGTGIGCAATCCT-3'（下劃線表示LNA修飾位點）。
[0051] 實施例3
[0052] 本實施例中煙草青枯病菌實時熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0053] 1)標準曲線的繪制
[0054] 以煙草青枯病菌（Ralstoniasolanacearum)的EG基因（GenBank登錄號為 YP_007631855. 1)設(shè)計LNA引物，引物如下：
[0055]正向引物：5 ' -TACCGCAICAAASAGGGCAG-3 '，
[0056] 反向引物：5'-CTTCTGSGGTGIGCAATCCT-3'（下劃線表示LNA修飾位點）；
[0057] 以包含青枯病菌EG基因片段的質(zhì)粒DNA為標準陽性對照樣品，利用正、反向引物 進行SYBRGreenI熒光定量PCR擴增（PCR擴增的反應體系為：2X熒光定量PCR反應混合 液12. 5yL，標準陽性對照樣品1yL，10ymol/L正/反向引物各1yL，ddH20補足至25yL; 反應條件為：95°C熱啟動，8min預變性；擴增循環(huán)：95°C30s，60°C10s，72°C20s，循環(huán)45 次），得到大小246bp的擴增片段（即煙草青枯病菌特異區(qū)DNA，電泳圖及測序圖分別見圖1 和圖2,測序結(jié)果如SEQIDN0. 3所示。圖1中泳道1、18為DL2000marker，泳道2、4、6、8、 10、12、14為1熟引物，泳道3、5、7、9、11、13、15為0嫩引物；泳道2、3退火溫度為70°(：，泳 道4、5退火溫度69. 2 °C，泳道6、7退火溫度67. 5 °C，泳道8、9退火溫度64. 5 °C，泳道10、11 退火溫度60. 9°C，泳道12、13退火溫度58. 0°C，泳道14、15退火溫度56. 0°C)，回收擴增片 段，并將其插入到載體PMD18-T中（連接體系及條件詳見Takara試劑盒說明書），42°C熱激 45s轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，并將其接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素在LB培養(yǎng) 基中的濃度為l〇〇ng/mL，培養(yǎng)24h后采用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后得到重 組質(zhì)粒PMD18-EG;
[0058] 將上述制備的重組質(zhì)粒PMD18-EG經(jīng)紫外分光光度計A260定量，測量值即為質(zhì)粒 母液的質(zhì)量濃度，然后將質(zhì)量濃度換算成拷貝數(shù)，再用滅菌后的超純水稀釋成3. 78X107、 3. 78X106、3. 78X105、3. 78X104、3. 78X103個/yL的濃度梯度得到逐級稀釋液，再利用 正、反向引物進行SYBRGreenI熒光定量PCR擴增（擴增反應體系為：2X熒光定量PCR 反應混合液12. 5yL，逐級稀釋液1yL，10ymol/L正/反向引物各1yL，ddH20補足至 25yL;反應條件同上；擴增曲線見圖3,圖中曲線1~5對應質(zhì)粒濃度依次為3. 78X103、 3.78\104、3.78\105、3.78\10 6和3.78\107個/1^)，每級稀釋液均擴增出 246匕口的產(chǎn) 物，記錄每級稀釋液的CT值，以每級稀釋液中青枯病菌拷貝數(shù)對數(shù)值為X軸、CT值為Y軸 制得標準曲線：y= -3. 328x+54. 33(R2= 0? 9938)(見圖 4);
[0059] 2)采集江西省撫州市煙區(qū)感染青枯病煙株附近的土壤（編號見下表1)并提取 DNA，利用正、反向引物進行SYBR Green I熒光定量PCR擴增（擴增反應體系為：2X熒光 定量PCR反應混合液12. 5 y L，待測土壤樣品DNA溶液1 y L，10 y mol/L正/反向引物各 1 yL，ddH20補足至25yL ;反應條件為：95°C熱啟動，8min預變性；擴增循環(huán)：95°C 30s， 60°C 10s，72 °C 20s，循環(huán)45次），當擴增片段為246bp時，記錄此時土壤樣品DNA溶液的 CT值，擴增曲線和溶解曲線見圖5和圖6，將CT值代入步驟1)的標準曲線中，得到1 y L待 測土壤樣品DNA溶液中煙草青枯病菌的個數(shù)；
[0060] 3)將步驟2)中個數(shù)代入以下公式，計算得到單位質(zhì)量樣品中青枯病菌的定殖數(shù) 量，結(jié)果見下表1 ;
[0061 ] C=QX(VDNA/VPCR)X(l/ffEXT),
[0062] 式中：C為單位質(zhì)量待測樣品中青枯病菌的定殖數(shù)量；Q為PCR反應體系中青枯病 菌的數(shù)量；VDNA/Vrc#待測樣品的稀釋倍數(shù)，其中VDNA為待測樣品稀釋后的總體積，VPeR為加 入PCR反應體系中的稀釋后待測樣品的體積；WEXT為待測樣品的質(zhì)量。
[0063] 表1 土壤樣品中煙草青枯病菌的定殖數(shù)量
[0064]
【主權(quán)項】
1. 煙草青枯病菌實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：包含以下引物： 正向引物：5 ' -TACCGCAJ：CAAAeAGGGCAG-3 '， 反向引物：5 ' -CTTCTGeGGTGIGCAATCCT-3 '。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于：還包含：2 X熒光定量PCR反應混 合液、標準陽性對照樣品、DNA Marker、超純水；所述標準陽性對照樣品為包含青枯病菌胞 外葡聚糖酶基因片段的DNA。3. 煙草青枯病菌實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：以待測樣品 DNA為模板，利用正、反向引物進行SYBR Green I熒光定量PCR擴增；擴增片段為246bp時， 將待測樣品DNA的CT值代入以青枯病菌拷貝數(shù)對數(shù)值為X軸、CT值為Y軸制作的標準曲 線中，得到PCR反應體系中青枯病菌的拷貝數(shù)；將拷貝數(shù)代入以下公式計算得到單位質(zhì)量 待測樣品中青枯病菌的定殖數(shù)量； C = QX (VDNA/VPCR) X (l/ffEXT), 式中：C為單位質(zhì)量待測樣品中青枯病菌的定殖數(shù)量；Q為PCR反應體系中青枯病菌 的數(shù)量；VDNA/Vrc#待測樣品的稀釋倍數(shù)，其中Vdna為待測樣品稀釋后的總體積，V PeR為加入 PCR反應體系中的稀釋后待測樣品的體積；Wext為待測樣品的質(zhì)量； 所述正、反向引物如下： 正向引物：5 ' -TACCGCAJ：CAAAeAGGGCAG-3 '， 反向引物：5 ' -CTTCTGeGGTGIGCAATCCT-3 '。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述SYBR Green I熒光定量PCR擴 增的反應體系為：2 X熒光定量PCR反應混合液12. 5 y L，待測樣品DNA溶液I y L，10 ymol/ L正/反向引物各I y L，CldH2O補足至25 y L。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述SYBR Green I熒光定量PCR擴 增的反應條件為：95°C熱啟動，8min預變性；擴增循環(huán)：95°C 30s，60°C 10s，72°C 20s，循 環(huán)45次。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述標準曲線的制作方法為： 1) 以標準陽性對照樣品為模板，利用正、反向引物進行SYBR Green I熒光定量PCR擴 增，得到大小246bp的擴增片段，回收擴增片段并將其插入到載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌并篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后得到重組質(zhì)粒PMD18 T-EG ; 2) 將重組質(zhì)粒pMD18 T-EG制成逐級稀釋液，再利用正、反向引物進行SYBR Green I熒 光定量PCR擴增，記錄每級稀釋液的CT值，以每級稀釋液中青枯病菌拷貝數(shù)對數(shù)值為X軸、 CT值為Y軸制得標準曲線。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于：步驟1)中所述標準陽性對照樣品為 包含青枯病菌胞外葡聚糖酶基因片段的DNA。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于：步驟1)、2)中所述SYBR Green I熒 光定量PCR擴增的反應體系為：2X熒光定量PCR反應混合液12. 5yL，標準陽性對照樣品 或重組質(zhì)粒PMD18 T-EG逐級稀釋液I y L，10 y mol/L正/反向引物各I y L，CldH2O補足至 25 u L09. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于：步驟1)、2)中所述SYBR Green I熒 光定量PCR擴增的反應條件為：95°C熱啟動，8min預變性；擴增循環(huán)：95°C 30s，60°C 10s， 72°C 20s，循環(huán) 45 次。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于：步驟2)中所述逐級稀釋液的制備 方法為：將步驟1)中重組質(zhì)粒PMD18 T-EG經(jīng)紫外分光光度計A260定量，測量值即為質(zhì)粒 母液的質(zhì)量濃度，用滅菌后的超純水稀釋成若干濃度梯度，即得。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草青枯病菌實時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以青枯病菌胞外葡聚糖酶基因(EG)區(qū)域片段為目標檢測序列，采用LNA技術(shù)合成覆蓋目標片段的引物序列，結(jié)合熒光定量核酸擴增技術(shù)，得到一種高靈敏度、高效快速檢測煙草青枯病菌的熒光定量核酸擴增檢測試劑盒。與普通引物常規(guī)熒光定量PCR檢測煙草青枯病菌相比，本發(fā)明中鎖核苷酸(LNA)增敏的煙草青枯病菌實時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法適用于植煙土壤青枯病菌的定量檢測，具有以下優(yōu)勢：高通量，高靈敏度，檢測時間較短，操作過程簡單，對待測樣品要求較低等。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號】CN105112555
【申請?zhí)枴緾N201510645013
【發(fā)明人】胡利偉, 馮小虎, 劉芳, 奚家勤, 熊尚彬, 萬應發(fā), 張蕊, 張志高, 唐徐紅, 姜麗芳, 周旋, 周國旺, 尹啟生, 宋紀真, 牟文君, 郭建華
【申請人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院, 江西省煙草公司撫州市公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年10月8日