一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強弱毒鑒別檢測試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強弱毒鑒別檢測試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬痕（ClassicalSwineFever，CSF)是由豬痕病毒（ClassicalSwineFever Virus，CSFV)引起豬的一種急性、熱性和高度接觸傳染的病毒性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)危害十分 嚴重，是世界糧農(nóng)組織和各國政府密切關(guān)注的主要傳染病，也是國際獸疫局（0IE)列為16 種A類法定傳染病之一。CSFV為正鏈RNA病毒，全基因組長12. 5kb左右，在分類學地位上 為黃病毒科，豬瘟弱毒疫苗在中國的大規(guī)模應用，使豬瘟野毒感染和疫苗接種的區(qū)分變得 非常困難但又十分必要。偽狂犬?。╬seudorabies，PR)又稱Aujeszky氏病，是由偽狂犬 病病毒（pseudorabiesvirus,PRV)引起的多種家畜（豬、牛、羊等）和野生動物以發(fā)熱、奇 癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的一種急性傳染病，該病屬于典型且極難防疫的自然 疫源性疾病之一，PRV屬于疤疹病毒目疤疹病毒科基因組大小約150kb。目前，豬瘟和偽狂 犬病已被列入《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃》（2012- 2020年）重點優(yōu)先防治的疫病，其 控制目標是：到2015年原種豬場達到凈化標準，到2020年全國所有種豬場達到凈化標準。 因此，亟待需要建立一種快速、高效、敏感、特異且同時能鑒別CSF和PR疫苗毒與野毒mPCR 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強弱毒鑒別檢測 試劑盒及其使用方法，能快捷有效地一次性區(qū)分CSF與PR弱毒免疫豬和野毒感染豬。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強弱毒鑒別檢測試劑盒，包含 Parti和Part2, Parti :2X1 Step Buffer 12. 5-25微升，RNase Free H20 7. 5-15微升， PrimeScript One Step Enzyme Mix 1-2微升，陽性對照；Part2 :SolutionA200-400微 升，Solution B 75-150微升，RinseA500-1000微升，Rinse B 800-1600微升，Elution Buffer 50-10微升，Spin Column 1支，Collection Tube 2支，薄壁PCR管1支，上樣緩沖 液1-2微升。
[0005] Part 1零下20 °C保存，Part2室溫保存。
[0006] -步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強弱毒鑒別檢測試劑盒的使用方法，包含以下步驟： (1) 取病料樣本，加入離心管中；后加入SolutionA，振蕩混勻后，室溫放置； (2) 加入SolutionB，混合均勻后，室溫放置，后離心；將上清液轉(zhuǎn)移到l#Collection Tube中，加異丙醇和冰乙酸混勻； (3) 將SpinColumn安置于2#CollectionTube上；將步驟（2)的上清液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，離心，棄濾液； (4) 將RinseA加入至上述SpinColumn中，室溫靜置，離心，棄濾液； (5) 將RinseB加入至SpinColumn中，離心，棄濾液；再次離心； (6) 將SpinColumn安置于離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入滅菌蒸餾水或 ElutionBuffer，室溫靜置；離心，洗脫病毒RNA/DNA，得到病料模板； (7) mPCR擴增：2XIStepBuffer、PrimeScriptOneStepEnzymeMix、CSFV野毒 上下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、上述病料模板和RNaseFreeH20進行PCR擴增反應； (8) 取PCR產(chǎn)物及陽性對照分別與上樣緩沖液混合均勻后，于1XTAE瓊脂糖凝膠中電 泳檢測，紫外燈下觀察結(jié)果，即可。
[0007] 首次使用前，在RinseA中添加12. 5mL的100%乙醇；在RinseB中添加31. 5mL 的100%乙醇。
[0008]CSFV野毒上下游引物： F1 :5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'， R1 :5' -GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'，片段 649bp。
[0009] CSFV疫苗毒上下游引物： F2 :5,-ACTCGGGGCCTGGACTAGACA-3,， R2 :5' -CGCCGAAAAAAGAAAAAAAAGAA-3'，片段 378bp。
[0010]PRVTK基因上下游引物： F3 :5,-TGGCGTACTGGCGCACTCTGTT-3,， R3 :5' -TGATGTCCCCGACGATGAAGCG-3'，片段 282bp。
[0011]PRVgB基因上下游引物： F4 :5'-AGGCCATCGACGCCATCTACCA-3'， R4 :5' -TGGAGTTCTGCACGTACACGCC-3'，片段 549bp。
[0012] PRVgE基因上下游引物： F5 :5'-GCGAGAACTTTACCGCCACGCT-3'， R5 :5' -TCGTCCTCGTCGCTGCTGAACT-3'，片段 829bp。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：現(xiàn)有的利用PCR檢測和診斷的方法較多，且只能單一檢測出 存在豬瘟或豬偽狂犬病毒感染，但不能區(qū)別是否為接種豬瘟或豬偽狂犬病免疫和自然野毒 所引起的感染；該多重PCR方法可一步同時區(qū)分豬瘟或豬偽狂犬病疫苗免疫豬和野毒感染 豬的鑒別，為首創(chuàng)。
【附圖說明】
[0014]圖1為鑒別豬瘟野毒與疫苗毒二重PCR方法特異性檢測結(jié)果；M:DL1000marker; 1:CSF野毒與疫苗毒PCR產(chǎn)物；2:CSF野毒PCR產(chǎn)物；3:CSF疫苗毒PCR產(chǎn)物；4 :PCV2PCR 產(chǎn)物；5:PRRSVPCR產(chǎn)物；6:PRVPCR產(chǎn)物；7 :E.coliPCR產(chǎn)物； 圖2為鑒別豬偽狂犬野毒與疫苗毒三重PCR方法特異性檢測結(jié)果；M.DLlOOOmarker; 1 :陰性對照；2:PRVGuizhou-DYPCR產(chǎn)物；3 :Bartha-K61 株P(guān)CR產(chǎn)物；4 :SA215 株P(guān)CR產(chǎn) 物；5 :PCV2PCR產(chǎn)物；6:PRRSVPCR產(chǎn)物；7:CSFVPCR產(chǎn)物；8 :E.coliPCR產(chǎn)物； 圖3、表1分別為鑒別豬瘟和豬偽狂犬野毒與疫苗毒五重PCR方法退火溫度優(yōu)化檢測結(jié) 果與其引物濃度配比量對應結(jié)果；M:DL1000DNAmarker;1-5 :不同引物濃度mPCR檢測結(jié) 果； 圖4為鑒別豬瘟和豬偽狂犬野毒與疫苗毒五重PCR方法總體系優(yōu)化檢測結(jié)果；M.DL1000marker;1 :100yL反應體系；2:50yL反應體系；3:30yL反應體系；4:25yL 反應體系； 圖5為鑒別豬瘟和豬偽狂犬野毒與疫苗毒五重PCR方法退火溫度優(yōu)化檢測結(jié)果；(M1，M2)DL(2000,1000)DNAmarker；1 ：61°C；2 ：60, 5 〇C；3：59. 6 〇C；4：58. 3 〇C；5：56. 7°C； 6 ：55. 3°C；7 ：54. 5°C；8 ：54°C； 圖6為鑒別豬瘟和豬偽狂犬野毒與疫苗毒五重PCR方法敏感性試驗檢測結(jié)果；(Ml，M2).DL(1000,2000)DNAmarker;1 :5°稀釋；2 :5 1 稀釋；3 :5 2稀釋；4 :5 3稀釋；5 :5 4稀 釋；6 :5 5稀釋；7 :5 6稀釋；8 :6 7稀釋；9 :5 8稀釋；10 :5 9稀釋；11:5w稀釋； 圖7為鑒別豬瘟和豬偽狂犬野毒與疫苗毒五重PCR方法特異性試驗檢測結(jié)果；(M1，M2).DL1000DNAmarker;1:CSF與PR多重PCR產(chǎn)物；2:PRVGuizhou-DYPCR產(chǎn)物；3 : Bartha-K61株P(guān)CR產(chǎn)物；4 :SA215株P(guān)CR產(chǎn)物；5 :CSF強弱毒混合PCR產(chǎn)物；6 :CSF野毒PCR 產(chǎn)物；7:CSF疫苗毒PCR產(chǎn)物；8 :PCV2PCR產(chǎn)物；9:PRRSVPCR產(chǎn)物；10:JEVPCR產(chǎn)物；11 : E.coliPCR產(chǎn)物。 【具體實施方式】
[0015]注明： +1酶使用時請置于冰盒上使用。
[0016] +2試劑含有強變性劑，應避免與皮膚、衣物等接觸。若不小心接觸到眼睛或皮膚， 請立即到醫(yī)院進行處理。
[0017] * 3首次使用前，請在RinseA添加12. 5mL的100%乙醇，混合均勻；請在RinseB 添加31. 5mL的100%乙 醇，混合均勻。
[0018] * 4準備異丙醇（1%冰乙酸）:在99mL的異丙醇中加入lmL冰乙酸，混合均勻，應于 室溫密閉保存，操作時應戴上雙層手套。
[0019] 實施例1 1病料模板核酸RNA的提取 操作前，提前把所需移液器、tip頭（全用RNA酶處理后的tip頭）、試劑盒、一次性手 套、異丙醇（1%冰乙酸）等放于工作臺，紫外燈照射30min。操作時全部在工作內(nèi)完成，且 帶雙層手套。SolutionA和SolutionB為DNA&RNA-步法核酸提取試劑盒中的，一步 法核酸提取試劑盒 一TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNA&RNAExtractionKit Ver. 4. 0購自大連寶生物工程有限公司。
[0020] (1)取200uL上述病料樣本，加入1.5mL離心管(可用一般EP管）中； (2) 加入200uL的SolutionA，劇