五重PCR/RT-PCR特異性試驗(yàn) 用已確定的五重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明，用最佳配比的混合引物對PR Guizhou-DY、Bartha-K61、SA215、CSF野毒株和弱毒疫苗（C-株）均擴(kuò)增出與各自病毒 目的片段大小符合的特異性條帶，而對PCV2、JEV、PRRSV、E. coli均未擴(kuò)增出條帶，說明特 異性較好（圖7)。
[0036] PCR產(chǎn)物的鑒定 分別對CSF野毒株和弱毒疫苗（C-株）、PRGuizhou-DY株、弱毒疫苗Bartha-K61株及 三基因缺失疫苗SA215株陽性樣品的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收連接至pMD19-T載體后，送上 海Invitrogen生物工程有限公司測序。對比各序列結(jié)果表明，擴(kuò)增片段分別為各自病毒的 特異性基因片段。
[0037] 重復(fù)性試驗(yàn) 用建立的多重PCR方法，對CSF野毒株和弱毒疫苗（C-株）、PRVGuizhou株、弱毒疫苗Bartha-K61株及三基因缺失疫苗毒SA215株進(jìn)行三次重復(fù)檢測，檢測結(jié)果均一致。
[0038] 多重PCR對臨床病料的檢測 對來自貴州省內(nèi)的臨床可疑病料樣品134份檢測結(jié)果表明：能繁母豬樣品CSF野毒與 疫苗毒混合陽性檢測率、CSF疫苗毒單獨(dú)陽性檢測率、PR野毒與疫苗毒混合陽性檢測率、PR 疫苗毒單獨(dú)陽性檢測率和CSF與PR野毒疫苗毒同時(shí)存在的五重陽性檢測率分別為28. 9% (ll/38)、73. 7%(28/38)、31. 6%(12/38)、94. 7%(36/38)和 7. 9%(3/38);育肥豬樣品CSF野 毒與疫苗毒混合陽性檢測率、CSF疫苗毒單獨(dú)陽性檢測率、PR野毒與疫苗毒混合陽性檢測 率、PR疫苗毒單獨(dú)陽性檢測率和CSF與PR野毒疫苗毒同時(shí)存在的五重陽性檢測率分別為 46. 2% (12/26)、69. 2% (18/26)、34. 6% (9/26)、76. 9% (20/26)和 19. 2% (3/38);保育豬樣品 CSF野毒與疫苗毒混合陽性檢測率、CSF疫苗毒單獨(dú)陽性檢測率、PR野毒與疫苗毒混合陽性 檢測率、PR疫苗毒單獨(dú)陽性檢測率和CSF與PR野毒疫苗毒同時(shí)存在的五重陽性檢測率分別 為 44. 4%(16/36)、75. 0%(27/36)、63. 9%(23/36)、88. 9%(32/36)和 25. 0%(9/36);哺乳仔豬 樣品CSF野毒與疫苗毒混合陽性檢測率、CSF疫苗毒單獨(dú)陽性檢測率、PR野毒與疫苗毒混合 陽性檢測率、PR疫苗毒單獨(dú)陽性檢測率和CSF與PR野毒疫苗毒同時(shí)存在的五重陽性檢測 率分別為 23. 5% (8/34)、76. 5% (26/34)、26. 5% (9/34)、88. 2% (30/34)和 17. 6% (6/34)(表 3)。 經(jīng)5重PCR檢測陽性的病料，再經(jīng)單一病毒PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，兩者結(jié)果符合率為98. 6%。
[0039] 在多重PCR反應(yīng)中，引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要，它是決定多重PCR成敗的關(guān)鍵。本研究針 對等部分基因片段，應(yīng)用PrimerPremier5.0、Oligo7.4、MFEprimer和MPprimer軟件進(jìn) 行綜合分析，挑選最佳一組，并充分考慮PRVG+C含量較高和CSFVG+C含量較低的問題，確 保Tm值應(yīng)該控制在54°C-61°C，確保在同一溫度都能進(jìn)行良好的PCR反應(yīng)，盡量避免引物 間非特異性擴(kuò)增，通過大量的預(yù)試驗(yàn)，先確定單一PCR反應(yīng)的最佳條件范圍，探索多重PCR 各自最佳反應(yīng)條件的交集，最后確定最佳反應(yīng)條件。預(yù)實(shí)驗(yàn)保證了多重PCR常見的因引物 之間交叉干擾而導(dǎo)致敏感性降低的缺點(diǎn)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該多重PCR敏感性較強(qiáng)，檢 測含量達(dá)到了pg級。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒，其特征在于：包含Partl和 Part 2，Partl:2Xl Step Buffer I2. 5_25微升，RNase Free H2O L5-I5微升，PrimeScript One St印 Enzyme Mix 1-2微升，2XGC Buffer 12.5-25 微升，lOmmol/L dNTPs 1-2 微升， Taq DNA聚合酶 LO微升，陽性對照；Part2:Solution A 200-400微升，Solution B 75-150 微升，Rinse A 500-1000 微升，Rinse B 800-1600 微升，Elution Buffer 50-10 微升，Spin Column 1支，Collection Tube 2支，薄壁PCR管1支，上樣緩沖液1-2微升。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒，其特征 在于：Partl零下20°C保存，Part2室溫保存。3. 如權(quán)利要求1或2所述的一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒的使 用方法，其特征在于：包含以下步驟： (1) 取病料樣本，加入離心管中；后加入Solution A，振蕩混勻后，室溫放置； (2) 加入Solution B，混合均勻后，室溫放置，后離心；將上清液轉(zhuǎn)移到l#Collection Tube中，加異丙醇和冰乙酸混勻； (3) 將Spin Column安置于2#Collection Tube上；將步驟（2)的上清液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，離心，棄濾液； (4) 將Rinse A加入至上述Spin Column中，室溫靜置，離心，棄濾液； (5) 將Rinse B加入至Spin Column中，離心，棄濾液；再次離心； (6) 將Spin Column安置于離心管上，在Spin Column膜的中央處加入滅菌蒸餾水或 Elution Buffer，室溫靜置；離心，洗脫病毒RNA/DNA，得到病料模板； (7) mPCR 擴(kuò)增：2X1 Step Buffer、PrimeScript One Step Enzyme Mix、CSFV 野毒上 下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、PRV TK基因上下游引物、PRV gB基因上下游引物、PRV gE基因上下游引物、上述病料模板和RNase Free H2O進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； (8) 取PCR產(chǎn)物及陽性對照分別與上樣緩沖液混合均勻后，于I X TAE瓊脂糖凝膠中電 泳檢測，紫外燈下觀察結(jié)果，即可。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒的使用 方法，其特征在于：首次使用前，在Rinse A中添加12. 5mL的100%乙醇；在Rinse B中添加 31. 5mL 的 100% 乙醇。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒的使用 方法，其特征在于：CSFV野毒上下游引物： Fl :5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'， Rl :5' -GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'，片段 649bp。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒的使用 方法，其特征在于：CSFV疫苗毒上下游引物： F2 :5,-ACTCGGGGCCTGGACTAGACA-3,， R2 :5' -CGCCGAAAAAAGAAAAAAAAGAA-3'，片段 378bp。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒的使用 方法，其特征在于：PRV TK基因上下游引物： F3 :5,-TGGCGTACTGGCGCACTCTGTT-3,， R3 :5' -TGATGTCCCCGACGATGAAGCG-3'，片段 282bp。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒的使用 方法，其特征在于：PRV gB基因上下游引物： F4 :5'-AGGCCATCGACGCCATCTACCA-3' ， R4 :5' -TGGAGTTCTGCACGTACACGCC-3'，片段 549bp。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒的使用 方法，其特征在于：PRV gE基因上下游引物： F5 :5'-GCGAGAACTTTACCGCCACGCT-3' ， R5 :5' -TCGTCCTCGTCGCTGCTGAACT-3'，片段 829bp。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一步法豬瘟與豬偽狂犬mPCR強(qiáng)弱毒鑒別檢測試劑盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1？Step？Buffer？12.5-25微升，RNase？Free？H2O？？7.5-15微升，PrimeScript？One？Step？Enzyme？Mix？1-2微升，2×GC？Buffer？12.5-25微升，10mmol/L？dNTPs？1-2微升，Taq？DNA聚合酶1.0微升，陽性對照；Part2：Solution？A？200-400微升，Solution？B？75-150微升，Rinse？A？500-1000微升，Rinse？B？800-1600微升，Elution？Buffer？50-10微升，Spin？Column？1支，Collection？Tube？2支，薄壁PCR管1支，上樣緩沖液1-2微升。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公開號】CN105112563
【申請?zhí)枴緾N201510542197
【發(fā)明人】湯德元, 李達(dá), 馬萍, 曾智勇, 劉霞, 唐宇, 方英, 王洪光, 韋冠東
【申請人】貴州大學(xué), 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月31日