yA，7 :pET-R2-ClyA，8 :pET-R3-ClyA;w/o:無蛋白酶，w/ :有蛋白酶）。
[0068] 圖16是分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（dxs) 和IPP異構(gòu)酶（idi)的表達(dá)量（A)和番茄紅素生成量⑶的圖。以R表示的是融合 標(biāo)記的蛋白質(zhì)，生成量通過HPLC進(jìn)行確認(rèn)（泳道1 :pTrc99A，2 :pTrc99A-dxs_idi，3 : pTrc99A-R-dxs-R_idi，WT:pTrc99A-dxs_idi，RT:pTrc99A-R-dxs-R_idi)。
[0069] 圖17是分析在酵母中包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的酯酶（1767)的 表達(dá)量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，表達(dá)量通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行確認(rèn)（1767: PYES2-1767,RY-1767 :pYES2-RY-1767,T:全體蛋白質(zhì)，S:可溶性蛋白質(zhì)，I:不溶性蛋白 質(zhì)）。
[0070] 圖18是分析在中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHOcell)中包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramp tag)的B3(Fv)PE38基因的表達(dá)量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，s是密碼子優(yōu)化 合成基因。表達(dá)量通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行確認(rèn)（泳道1 :pCMV，2 :pCMV-B3Fv，3 :PCMV-sB3Fv， 4:pCMV-RC-B3Fv)。
[0071] 圖19是分析在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH3T3cell)中包含本發(fā)明的RAMP標(biāo) 記（ramptag)的B3(Fv)PE38基因的表達(dá)量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，s是 密碼子優(yōu)化合成基因。表達(dá)量通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行確認(rèn)（泳道1 :pCMV，2 :pCMV-B3Fv，3 : pCMV-sMB3Fv，4 :pCMV-RM-B3Fv)。
[0072] 圖20是分析在人類細(xì)胞（HEK293tcell)中包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag) 的天冬酰胺酶B(ansB)的表達(dá)量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，表達(dá)量通過蛋白 質(zhì)印跡進(jìn)行確認(rèn)（ansB:pCMV-ansB，RH_ansB:pCMV_RH_ansB，T:全體蛋白質(zhì)，S:可溶性蛋白 質(zhì)，I:誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)）。
[0073] 圖21是在LB培養(yǎng)基（A)和M9培養(yǎng)基（B、C)中分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramp tag)的內(nèi)酰胺酶（beta-lactamase VIM2)的抗生素敏感性檢查的圖（w/o :無Zn2+，w/: 有 Zn2+)。
[0074] 圖22是分析在本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)中包含同時(shí)賦予了蛋白質(zhì)純化 和表達(dá)誘導(dǎo)功能的組氨酸稀有密碼子而增加的蛋白質(zhì)（mBFP)表達(dá)量（A)和利用親和層 析分離的純度（B)的圖（泳道 1 :pTrc99A，2 :pTrc99A-mBFP，3 :pTrc99A-RHl-mBFP，4 : pTrc99A-RH2-mBFP)〇
【具體實(shí)施方式】
[0075] 下面，根據(jù)具體實(shí)施例更詳細(xì)說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限定于下述實(shí)施例。在 本發(fā)明的思想和范圍內(nèi)可以進(jìn)行多種變形或修正對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
[0076] 此時(shí)，所使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語中，如果沒有其它定義，則具有本發(fā)明所屬技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，省略對(duì)于與以往相同的技術(shù)構(gòu)成和作用的 反復(fù)說明。
[0077] 本發(fā)明構(gòu)成在各宿主中收集稀有密碼子的方式。在此，所謂的稀有密碼子除了指 通常已知的稀有密碼子的概念之外，還指在下面說明的過程中收集的密碼子。在解碼密碼 子時(shí)，對(duì)翻譯速度影響最大的是，以多快的速度供應(yīng)處于結(jié)合氨基酸的狀態(tài)的aa-tRNA。由 此，在細(xì)胞內(nèi)充分存在相應(yīng)aa-tRNA的量的密碼子中翻譯速度快，相反，aa-tRNA的不足使 翻譯效率降低。因此，tRNA的基因拷貝（genecopy)可以用作能夠類推細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)tRNA的 濃度的第一尺度。眾所周知，典型的密碼子優(yōu)化方法反映密碼子頻率（codonfrequency)， 這是因?yàn)?，已知密碼子頻率與相應(yīng)tRNA拷貝數(shù)成比例。下表1顯示出在大腸菌K-12中與 各氨基酸（AA)對(duì)應(yīng)的密碼子頻率（100%基準(zhǔn)）和tRNA基因拷貝(http://gtrnadb.ucsc. edu/) 〇
[0078]表1.大腸菌K-12菌株的密碼子使用的構(gòu)成[0079]
[0080] 觀察上述表的密碼子頻率可知，與tRNA基因不成比例的氨基酸很多。而且， 即使密碼子頻率高，也可見沒有tRNA基因，可以如下說明發(fā)生該現(xiàn)象的原因：tRNA的 反密碼子（anticodon)可以通過搖擺（wobble)現(xiàn)象（在第三個(gè)位點(diǎn)，非沃森-克里克 (non-Watson-Crick)互補(bǔ)結(jié)合）識(shí)別其它密碼子（表2)。將這樣能夠識(shí)讀兩個(gè)以上的密 碼子的tRNA稱為同工受體tRNA。例如，識(shí)讀苯丙氨酸（phenylalanine)的UUC的tRNA(反 密碼子GAA)也能識(shí)讀UUU。在大腸菌K-12中具有反密碼子G和U的tRNA解碼大部分的 U、C、A、G密碼子。
[0081] 表2.反密碼子通過搖擺現(xiàn)象能夠解碼的密碼子
[0082]
[0083] 在選定考慮到tRNA的不足的稀有密碼子時(shí)，應(yīng)考慮同工受體tRNA，選定在0RF中 需要再使用（reuse)tRNA的密碼子。例如，0RF中可編碼絲氨酸（serine)的密碼子中顯 示出低頻率的UCU密碼子雖然能夠阻礙翻譯速度，但是如果在UCU密碼子的前面出現(xiàn)UCC， 則UCC所使用的tRNA能夠再使用于解碼UCU，因此UCU無法阻礙翻譯速度。由此，密碼子 頻率（codonfrequency)是將同工受體tRNA識(shí)讀的兩個(gè)密碼子頻率加算而在下述分析 過程中以一個(gè)進(jìn)行計(jì)算。苯丙氨酸（phenylalanine)的密碼子頻率為兩個(gè)密碼子的合計(jì) 即3. 87 %，在Ser的情況下，如表1所示，分別分成兩個(gè)密碼子，使共3種密碼子的頻率為 1. 66%、1. 60 %、2. 47%，與此相應(yīng)的tRNA基因拷貝也將兩個(gè)密碼子加算而視為2、2、1個(gè)。 在密碼子使用中，如果說明另一個(gè)特征的話，具有密碼子偏性（codonbia)為3個(gè)以上的同 義密碼子（synonymouscodon)的氨基酸中表現(xiàn)出更加強(qiáng)烈（表1)。例如，甘氨酸（glycine) 顯示5. 45%和1. 90%的頻率而顯示出差距。同樣地，精氨酸（arginine)的密碼子頻率顯示 出4. 29%、0. 89%、0. 31 %這樣大的差距。相反，在大腸菌中由2個(gè)密碼子編碼的氨基酸即 酪胺酸（tyrosine)、組氨酸（histidine)、谷氨酰胺（glutamine)、天冬氨酸（aspartate)、 賴氨酸（lysine)、天冬酰胺（asparagine)被解碼為一個(gè)同工受體tRNA而僅具有一種tRNA 基因，大多數(shù)的2個(gè)密碼子均顯示出2-5%程度的高頻率，可見密碼子偏性弱。
[0084][實(shí)施例1]大腸菌中稀有密碼子（rarecodon)的新的定義和收集基準(zhǔn)
[0085] 兩個(gè)以上的同工受體tRNA參與由3個(gè)以上的密碼子（根據(jù)密碼子數(shù)，分別表示 為3、4、6盒（box))編碼的氨基酸絲氨酸（serine)、亮氨酸（leucine)、結(jié)|氨酸（valine)、 脯氨酸（proline)、蘇氨酸（threonine)、丙氨酸（alanine)、精氨酸（arginine)、甘氨酸 (glycine)的翻譯，考慮此的密碼子對(duì)（將同工受體tRNA看作一個(gè)）也是2個(gè)以上的情況 居多，因此頻率差距大的可能性高?？梢哉J(rèn)為密碼子稀有性是在如果在0RF中不具有多個(gè) 密碼子則難以充分確保tRNA的3-6盒中大。由此可知，再使用tRNA確保充分的翻譯效率 的策略是在同工受體tRNA不足的3-6盒密碼子中必需的。為了獲得這樣的效果，本發(fā)明的 策略是在收集利用頻率低的密碼子序列而構(gòu)成標(biāo)記后，配置于表達(dá)目標(biāo)基因之前，預(yù)先聚 集對(duì)基因的表達(dá)效率誘發(fā)嚴(yán)重問題的稀有密碼子tRNA而再使用（圖1)。由于以所構(gòu)成的 標(biāo)記所選用的tRNA的再使用為目的，因此在本發(fā)明中沒有考慮由基于標(biāo)記的tRNA的絕對(duì) 使用次數(shù)增加引起的生物體內(nèi)氨基酸濃度減少。
[0086] 然后，考慮上述密碼子使用，公開收集稀有密碼子的條件。作為針對(duì)以往典型的方 法的補(bǔ)充措施，混用了考慮各密碼子頻率的方法和考慮同工受體tRNA的基因拷貝數(shù)的方 法。以密碼子頻率為基準(zhǔn)，稀有密碼子收集條件如下：1.各氨基酸中密碼子對(duì)頻率為1.0% 以下者（該閾值是可收集總密碼子個(gè)數(shù)的下位34. 4% (21個(gè)）的水準(zhǔn)）；2.針對(duì)一個(gè)氨基 酸最多收集3個(gè)密碼子。
[0087] 上述條件的臨界值需要參考大腸菌的全體密碼子如何分布，因此參考將密碼子頻 率和tRNA基因數(shù)作為軸的分布（表3)。.
[0088] 表3.密碼子頻率和tRNA基因數(shù)的分布
[0089]
[0090] *tRNA，** 密碼子頻率（Codonfre.)，林* 有效搖擺（Infficientwobble)
[0091] 編碼大部分的氨基酸的密碼子顯示出分布于0-2個(gè)tRNA基因和0. 5-3%以上密碼 子頻率的模式。在此，為了收集稀有密碼子而應(yīng)用了與上述括號(hào)相同的基準(zhǔn)，其中，作為實(shí) 驗(yàn)結(jié)果，包含確定為稀有密碼子的9個(gè)密碼子。這樣選擇了同時(shí)考慮密碼子頻率和同工受 體tRNA的方式。表4是最終收集的大腸菌K-12菌株的稀有密碼子表。
[0092] 表4.大腸菌K-12菌株的收集的稀有密碼子
[0093]
[0094] 基于此，本發(fā)明提供構(gòu)成RAMP標(biāo)記（ramptag)的方法并說明發(fā)揮功能的原理。 RAMP標(biāo)記中排列著約1-20個(gè)密碼子。這樣的構(gòu)成和排列方式根據(jù)與RAMP標(biāo)記融合的基因 而不同。此外，根據(jù)目標(biāo)基因的長度和基因內(nèi)部的稀有密碼子的分布程度，可以將標(biāo)記的長 度構(gòu)成為20個(gè)以上，但在利用轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)（transcriptionalcoupling)技術(shù)的情況下，由于 與目標(biāo)基因分開表達(dá)的標(biāo)記而存在氨基酸不足（標(biāo)記表達(dá)中所使用的氨基酸比率增加）的 可能性，因此需要限制長度。
[0095][實(shí)施例2]將與各基因融合的RAMP標(biāo)記的序列和結(jié)構(gòu)體（construct)的構(gòu)成
[0096] 參考圖2A，通過下述過程，構(gòu)成RAMP標(biāo)記（ramptag) :1.制作基于宿主的稀有、 偏愛密碼子表；2.將目標(biāo)基因的DNA序列更換為密碼子進(jìn)行準(zhǔn)備；3.分析所制作的密碼子 表中的密碼子在目標(biāo)基因0RF中出現(xiàn)的頻率和位置；4.將分析的密碼子組合并排列在RAMP 標(biāo)記中；5.在目標(biāo)基因的N-或C-末端內(nèi)外部（與標(biāo)記長度對(duì)應(yīng)的1-20個(gè)密碼子）融合 或置換標(biāo)記而誘導(dǎo)表達(dá)。
[0097] 這樣的標(biāo)記構(gòu)成為：在核糖體解碼標(biāo)記時(shí)，首先引入0RF翻譯中所需的tRNA后在 0RF中可再使用。圖1B描述這樣的翻譯過程，說明RAMP標(biāo)記（ramptag)的工作原理和策 略。為了使RAMP標(biāo)記準(zhǔn)確地工作，需要在蛋白質(zhì)翻譯中所利用的tRNA在核糖體中再使用 之前借助于氨酰-tRNA合成酶與氨基酸結(jié)合（補(bǔ)給（recharging))。由此，本發(fā)明的驅(qū)動(dòng)條 件是用過一次的tRNA在進(jìn)行翻譯過程的期間不會(huì)擴(kuò)散到遠(yuǎn)處以便容易被再使用，并與氨 基酸再結(jié)合。
[0098] 標(biāo)記的密碼子配置考慮0RF中出現(xiàn)的頻率和位置。為了增加翻譯過程中的借助于 RAMP標(biāo)記的tRNA的再使用效果，在稀有密碼子中篩選出如下密碼子：0RF中出現(xiàn)的頻率少 而遲延翻譯過程，且分布的位置接近N-末端側(cè)或者在0RF內(nèi)部周期性出現(xiàn)。即，在稀有密 碼子中，按照0RF中出現(xiàn)的頻率少的順序分析稀有密碼子后，優(yōu)先配置分析的密碼子在0RF 中位于前半部的情況。已知，在構(gòu)成RAMP標(biāo)記時(shí)，如果僅將稀有密碼子組合使用，則翻譯過 程（translation)受阻，減少蛋白質(zhì)生產(chǎn)。即報(bào)道了，在大腸菌的情況下，即使僅使用1個(gè) 連續(xù)的稀有密碼子，也阻礙部分翻譯（SheP.等，2006)。由此，為了通過稀有密碼子和偏愛 密碼子的組合，解決連續(xù)的稀有密碼子的翻譯過程中的問題，利用上述分析方法將偏愛密 碼子分類并組合。就密碼子之間的組合而言，在稀有密碼子之間配置偏愛密碼子，但根據(jù)目 標(biāo)蛋白質(zhì)的不同而偏愛密碼子數(shù)、RAMP標(biāo)記中先配置的順序和相同密碼子的重復(fù)性不同。
[0099] 本發(fā)明為了提供針對(duì)蛋白質(zhì)過表達(dá)（或難表達(dá)）的RAMP標(biāo)記密碼子，確認(rèn)了以與 目標(biāo)基因的內(nèi)外部融合的形態(tài)建模的可能性。以熒光蛋白質(zhì)即DsReD、GFP、mBFP為對(duì)象，設(shè) 計(jì)了與它們匹配的標(biāo)記和融合有標(biāo)記的基因結(jié)構(gòu)體。觀察圖2B，標(biāo)記以位于基因的N-末端 (或5'末端）外部的方式進(jìn)行融合或者以獨(dú)立的形態(tài)進(jìn)行表達(dá)。但并不限于此，可以用引 物（primer)設(shè)計(jì)RAMP序列而通過PCR簡單地導(dǎo)入基因N-末端內(nèi)部，以使野生型蛋白質(zhì)的 氨基酸不發(fā)生變化。下述實(shí)施例中標(biāo)示了針對(duì)各基因的標(biāo)記的DNA序列。首先，在前述的 3個(gè)基因上融合與其匹配的標(biāo)記，在可誘發(fā)tRNA的不足現(xiàn)象的誘導(dǎo)表達(dá)載體（induction vector)中嘗試進(jìn)行表達(dá)。作為另一個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，利用不需要誘導(dǎo)體的組成型過表達(dá)載體
[0100][實(shí)施例3]在熒光蛋白質(zhì)DsReD、GFP、mBFP中分析借助于RAMP標(biāo)記融合的表達(dá) 量
[0101] 下表5中羅列了針對(duì)各基因的RAMP標(biāo)記的密碼子序列。RAMP標(biāo)記通過如圖2所 示的過程而收集，使其配置于基因的前端，與蛋白質(zhì)融合而誘導(dǎo)表達(dá)。借助于RAMP標(biāo)記的 過表達(dá)效果利用作為組成型表達(dá)載體的PBEM3、pRCEMT和作為誘導(dǎo)表達(dá)載體的pET22b(+) 來確認(rèn)。對(duì)于各載體，先克隆基因后，以添加了ATG的正向引物（forwardprimer)形態(tài)合 成表5 (基因特異性RAMP標(biāo)記（ramptag)序列）的標(biāo)記序列，以各基因?yàn)槟０澹╰emplate) 進(jìn)行PCR，得到連接RAMP標(biāo)記的基因片段。之后，將多克隆位點(diǎn)（multi-cloningsite)的 限制酶識(shí)別位點(diǎn)切割并克隆，轉(zhuǎn)化到大腸菌XLl-blue和BL21。上述重組基因穩(wěn)定地維持具 有熒光蛋白質(zhì)的載體，也可以用于能夠測定熒光的公知的任何宿主細(xì)胞。例如，也可以利用 E.coliJM109或RR1、LE392或W3110等以及作為真核細(xì)胞的釀酒酵母（Saccharomyces)或 畢赤酵母（Phichia)等作為宿主。
[0102] 關(guān)于將具有上述本發(fā)明的RAMP標(biāo)記的載體搬運(yùn)到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法，在宿主細(xì) 胞為原核細(xì)胞的情況下，可以通過CaCl2方法、FSB溶液處理法或電擊法等實(shí)施。此外，在宿 主細(xì)胞為真核細(xì)胞的情況下，可以通過電穿孔法或脂質(zhì)體-介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法等，將具有上述重 組基因的載體注入宿主細(xì)胞。
[0103] 將上述轉(zhuǎn)化的單一菌落接種于5ml液體培養(yǎng)基（LB+50mg/ml氨芐青霉素），以 37°C、200rpm的條件預(yù)培養(yǎng)12小時(shí)。當(dāng)上述培養(yǎng)液的吸光度（0D6J值達(dá)到2. 0時(shí)，接種 于200ml的液體培養(yǎng)基（LB+50mg/ml氨芐青霉素），在相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)后，當(dāng)吸光度 (〇D6J值為0. 5時(shí)，利用0.ImM異丙基-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)通過Ptac啟 動(dòng)子的表達(dá)。3小時(shí)后，將培養(yǎng)液取樣，根據(jù)吸光度（0D_)值測定細(xì)胞密度。將細(xì)胞密度 調(diào)整為0D6M= 2. 0,在7,OOOrpm下將lml的分樣量離心分離5分鐘后，去除上澄液，利用 SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)表達(dá)量。
[0104] 表5.基因特異性的RAMP標(biāo)記（ramptag)序列
[0105]
[0106] 結(jié)果是，在誘導(dǎo)表達(dá)載體中添加IPTG后，利用SDS-PAGE，與對(duì)照組比較蛋白質(zhì)表 達(dá)量時(shí)，在融合有標(biāo)記的DsRed(R-DsRed)中觀察到總蛋白質(zhì)量增加3. 7-5. 8倍以上（圖 3A)。該結(jié)果表示，通過標(biāo)記的融合賦予tRNA的選擇和再使用功能，由此蛋白質(zhì)表達(dá)量增 加。同樣地分析針對(duì)GFPuv和mBFP的RAMP標(biāo)記的效果，結(jié)果可以確認(rèn)到，與對(duì)照組（GFPuv、 BFP)相比，融合有RAMP標(biāo)記的GFPuv(R-GFP)、mBFP(R-BFP)的總蛋白質(zhì)量也分別增加5. 4 倍、2. 6倍以上（圖3B、C)。在上述條件下不添加表達(dá)誘導(dǎo)劑（IPTG)而進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，與利用 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)過表達(dá)的表達(dá)量類似或表達(dá)量增加了其以上（3. 5-7. 8倍）。
[0107][實(shí)施例4]以往的表達(dá)要素和借助于RAMP標(biāo)記融合的表達(dá)量分析
[0108] 在本實(shí)施例中，提供將RAMP標(biāo)記與典型的重組蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)要素一起使用的 方法。作為以往的大腸菌（E.coli)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)成要素，使用了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，為了優(yōu)化 的翻譯，在mRNA的起始密碼子之前導(dǎo)入核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RibosomeBindingSite，RBS)。 此外，使轉(zhuǎn)錄物二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化要素包含于5'非翻譯區(qū)（untranslatedregion，U