TR)。在哺 乳動物細胞的情況下，包含哺乳動物復(fù)制起點SV40起點作為質(zhì)粒構(gòu)成要素，使用誘導(dǎo)型啟 動子。為了優(yōu)化的翻譯，使Kozak序列包含于5'非翻譯區(qū)。加入降低mRNA二級結(jié)構(gòu)形成 可能性的要素和剪接信號，融合RAMP標記（ramptag)，分析了蛋白質(zhì)的表達。其結(jié)果是，不 妨礙對穩(wěn)定性或有效的轉(zhuǎn)錄/翻譯誘導(dǎo)發(fā)揮特別功能的表達系統(tǒng)的作用，并且在原核宿主 (大腸菌）中可以確認到借助于RAMP標記（ramptag)的表達量增加（圖4)。關(guān)于功能評 價，在質(zhì)粒中分別組裝誘導(dǎo)型啟動子Ptrc、核糖體結(jié)合位點和強制轉(zhuǎn)錄終止位點（轉(zhuǎn)錄終 止信號T1和T2)后，使RAMP標記融合于熒光蛋白質(zhì)mBFP后進行。此時使用的RAMP標記 如表6所示。在上述過程中利用真核作為宿主與以往表達要素嫁接的實驗中，也驗證了同 樣的效果，從而確認到能夠容易將RAMP標記嫁接到以往系統(tǒng)。
[0109] 表6.基因特異性的RAMP標記（ramptag)序列
[0110]
[0111][實施例5]在轉(zhuǎn)錄階段測定借助于RAMP標記序列的基因的表達水平
[0112] 通過上面實施的實施例，確認到RAMP標記序列使蛋白質(zhì)的表達量增加的事實。由 此，本發(fā)明人為了確認由RAMP標記序列差異所引起的蛋白質(zhì)的表達量增加除了影響翻譯 (translation)階段之外是否還影響由各個DNA轉(zhuǎn)錄到信使RNA(mRNA)的遺傳信息（轉(zhuǎn)錄 物（transcript))量，分析了焚光蛋白質(zhì)mBFP的轉(zhuǎn)錄階段和翻譯階段中的基因表達水平。 利用與上述實施例3的方法相同的方法，準備載體后并使其表達，進行SDS-PAGE電泳后，在 翻譯階段分析蛋白質(zhì)表達量，獲得相同的結(jié)果。之后，為了確認準備的上述試樣的mBFP轉(zhuǎn) 錄物量，進行了RT-PCR。首先使用Trizol試劑（Invitrogen，Catno. 15596-026)方法，從 用上述載體轉(zhuǎn)化的大腸菌細胞提取全體RNA。在利用提取的RNA作為模板的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中， 利用分離的RNA0? 2和SuperscriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，Cat.No. 18064-022)合成 cDNA。然后，利用ExTaq(TaKaRa，Catno.RR001A)進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)。此時，作為對照 組，使用GAPDH基因。用于確認mBFP的轉(zhuǎn)錄量的引物示于表7,關(guān)于PCR條件，將退火溫度固 定在55°C而進行。其結(jié)果可以確認到，與沒有標記的對照組相比，導(dǎo)入了pTrc99A-Rl-BFP 等RBS的R1-BFP和R2-BFP的測定轉(zhuǎn)錄量高1. 7-2. 4倍程度（圖5)。
[0113] 由此通過上述結(jié)果，本發(fā)明人可以獲知，借助于RAMP標記的蛋白質(zhì)表達量差異除 了具有由于在翻譯階段賦予tRNA的選擇和再使用功能而增加表達的主要效果之外，還具 有增加從DNA轉(zhuǎn)錄到信使RNA的遺傳信息的穩(wěn)定性而提高蛋白質(zhì)的表達量的附隨效果。產(chǎn) 生該結(jié)果的原因被推測為，借助于RAMP標記良好地調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的核糖體的速度，從 而暴露于核酸內(nèi)切酶的轉(zhuǎn)錄物的比率相對少，有效誘導(dǎo)核糖體的再循環(huán)。
[0114] 表7.RT-PCR引物序列
[0115]
[0116][實施例6]帶有RAMP標記融合基因的宿主生長影響分析
[0117] 在本實施例中，為了確認RAMP標記是否對宿主生長誘發(fā)應(yīng)激，分析了帶有融合 有標記的熒光蛋白質(zhì)mBFP的宿主（大腸菌）的細胞生長曲線和由此獲得的蛋白質(zhì)表 達水平。與上述實施例3的方法同樣地準備載體后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，將由0.ImM異丙 基硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)表達的細胞隨時間取樣，根據(jù)吸光度（OD_)值測定 細胞濃度。與此同時，對于相同的試樣，通過SDS-PAGE電泳測定了蛋白質(zhì)表達量。其結(jié)果 如圖6所示，融合有RAMP標記的菌株與對照組相比沒有生長差異，表達誘導(dǎo)時間點以后，可 以確認到與對照組相比蛋白質(zhì)量明顯增加。由此，通過上述結(jié)果可知，RAMP標記不會對菌 株的細胞生長誘發(fā)應(yīng)激，并且使蛋白質(zhì)過表達。
[0118][實施例7]針對難表達工業(yè)/醫(yī)藥用蛋白質(zhì)的RAMP標記效果
[0119] 將前述的RAMP標記的效能應(yīng)用于附加價值高的難表達工業(yè)酶和藥物蛋白質(zhì)。藥 物蛋白質(zhì)溶細胞素（cytolysinA，ClyA)和天冬酰胺酶B(asparaginaseB，AnsB)、作為工 業(yè)用酶的酯酶（esterase，1767)和葡萄糖苷酶（0-glucosidase，SmGlu)、新普魯蘭酶 (neopullulanase，BCN)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicolacetyltransferase，CAT) 雖然應(yīng)用可能性很大，但是存在大量生產(chǎn)困難的缺點。針對這樣的蛋白質(zhì)，也制作RAMP 標記，利用實施例3的方法調(diào)查表達量時，可以確認到與對照組相比，蛋白質(zhì)量顯著增加 (2. 1-4. 8倍）（圖7)。為了確認過表達的蛋白質(zhì)是否具有功能性，利用紙片擴散法（disc diffusionassay)和酶譜法（zymography)分別測定氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)和天冬酰胺 酶B(AnsB)的酶活性。紙片擴散法通過如下過程進行。將大腸菌在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后， 取單一菌落接種于l〇ml液體培養(yǎng)基，進行3次傳代培養(yǎng)。利用傾注平板法將培養(yǎng)的菌株以 5X10細胞/ml接種于1 %瓊脂培養(yǎng)基后，滴加氯霉素（30yg/ml) 10y1，將在常溫干燥5分 鐘后的6_紙片放置于板中央并進行培養(yǎng)。培養(yǎng)后，測定從紙片形成的生長抑制圈的大小， 以mm單位表示。結(jié)果確認到，具有與SDS-PAGE表達狀態(tài)成比例的特性的功能性蛋白質(zhì)得 以過表達（圖8)。
[0120] 對于作為代表性的治療癌癥藥物的天冬酰胺酶B的功能性表達與否，利用活性 測定法進行測定，所述活性測定法中，根據(jù)指示劑（indicatordye)的顏色變化，檢測出 由作為基質(zhì)的天冬酰胺酶的水解產(chǎn)物即天冬氨酸引起的pH變化與否。用于此的酶譜法 (zymography)是將細胞培養(yǎng)液離心分離而分成細胞層（團塊）和上層液，破碎，利用非變 性-PAGE凝膠進行電泳后，對活性條帶用基質(zhì)溶液層（覆蓋的瓊脂（overlaidagar))進行 檢測的方法?；钚詸z測基質(zhì)溶液層通過在〇. 2M三磷酸鹽（tris-phosphate)、40mML-天冬 酰胺（L-asparagine)、10mM四苯硼鈉（sodiumtetraphenylborate)、l%瓊脂（agar)中添 加0.1%酸紅（phenolred)而制作，在37°C下實施2小時的活性染色反應(yīng)。結(jié)果確認到， 具有與SDS-PAGE表達狀態(tài)成比例的特性的功能性蛋白質(zhì)得以過表達（圖9)。由此確認到， RAMP標記不僅誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的過表達，而且不阻礙酶活性。通過利用借助于抗體的蛋白質(zhì)印 跡和檢測試劑盒（assaykit)的比較實驗，再次驗證上述結(jié)果。在本實施例中用于蛋白質(zhì) 表達誘導(dǎo)的RAMP標記的序列如表8所示。
[0121] 表8.工業(yè)、醫(yī)學(xué)用蛋白質(zhì)基因表達用RAMP標記序列
[0122]
[0123] 上述結(jié)果顯示，本發(fā)明在利用設(shè)計成與目標基因匹配的RAMP標記的情況下，能夠 直接利用于確保功能性的醫(yī)藥品或工業(yè)用酶的生產(chǎn)。
[0124][實施例8]RAMP標記融合重組蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析
[0125] 在本實施例中，對于由RAMP標記引起的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性影響和附帶穩(wěn)定性增加效 果的標記的功能進行評價。就蛋白質(zhì)穩(wěn)定性而言，在藥物或酶蛋白質(zhì)的情況下，賦予更加 穩(wěn)定地維持在生物體內(nèi)的特性，從而能夠起到倍增效果的作用?？v所周知，在蛋白質(zhì)的 N-末端可以存在與結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性有關(guān)的信號序列，因此融合可起到追加或保護具有 這些特性的序列的功能的RAMP標記來確認蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。此時，使用的目標蛋白質(zhì)是 作為抗癌藥物蛋白質(zhì)的天冬酰胺酶B(asparaginaseB)，使在實施例7中利用的RAMP標記 位于N-末端，誘導(dǎo)充分的蛋白質(zhì)的表達后，添加放線菌酮（Cycloheximide) (10/ml)，阻斷 新蛋白質(zhì)的表達，并確認已表達的蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)存在的時間。作為蛋白質(zhì)生物合成 抑制劑，有氯霉素（Chloramphenicol)、四環(huán)素類抗生素（四霉素（Tetramycin)、金霉素 (aureomycin))、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（紅霉素（Erythromycin)、白霉素（Leukomycin))、氨基 糖苷類抗生素（鏈霉素（Streptomycin)、卡那霉素（Kanamycin)、慶大霉素（Gentamycin)、 新霉素（Neomycin)、阿米卡星（Amikacin))、林可酰胺類抗生素（林可霉素（Lincomycin)、 克林霉素（Clindamycin))等，但并不限于此。其結(jié)果觀察到，與對照組相比，帶有RAMP標 記的重組蛋白質(zhì)在生物體維持時間更長（圖10)。結(jié)果可知，RAMP標記在使目標蛋白質(zhì)的 表達增加的同時賦予穩(wěn)定性，從而誘導(dǎo)能夠長時間發(fā)揮功能的特性。這樣的特性是由如下 效果引起的現(xiàn)象：與轉(zhuǎn)錄物天生具有的壽命（半衰期（half-life))有關(guān)的固有二級結(jié)構(gòu)因 RAMP標記而發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)機制喪失的效果；以及用于翻譯的核糖體的接近變得更加 容易進行，從而防止受到核酸水解酶影響的效果。
[0126][實施例9]RAMP標記的C-末端融合
[0127] 在上述所有實施例中，RAMP標記位于目標蛋白質(zhì)的N-末端。在包括真核細胞在 內(nèi)的大多數(shù)生物的翻譯過程中，經(jīng)過一次編碼mRNA的核糖體（ribosome)具有利用誘導(dǎo)了 環(huán)狀繩套形態(tài)（JIB]嘗讀）的mRNA的特性，以便容易再次編碼該mRNA，將這樣的現(xiàn)象稱 為核糖體再循環(huán)（recycling)。因此，RAMP標記即使位于目標蛋白質(zhì)的尾部即C-末端（或 轉(zhuǎn)錄物的3'末端），也可以通過核糖體的再循環(huán)而具有tRNA的再使用效果。根據(jù)這樣的 事實，通過將RAMP標記融合于C-末端進行表達或者使用翻譯偶聯(lián)技術(shù)（translational coupling)來確認蛋白質(zhì)量的增加與否。此時使用的目標蛋白質(zhì)是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (chloramphenicolacetyltransferase，CAT)，使實施例 7 中利用的RAMP標記位于目標 基因的C-末端（CAT-R)來驗證效果。結(jié)果是，與未融合標記的對照組相比，表達量增加 4. 7-6. 5倍以上。由此確認到，RAMP標記在C-末端與N-末端同樣地具有相同的蛋白質(zhì)過 表達誘導(dǎo)能力（圖11)。
[0128][實施例10]位于基因內(nèi)側(cè)的RAMP標記（ramptag)的制作和效果
[0129] 在本實施例中，設(shè)計了可以通過目標基因中（N-末端）的密碼子置換而將RAMP標 記的功能導(dǎo)入基因內(nèi)部來獲得效果的方法并進行實驗。上述實施例中所述的RAMP標記是 位于目標基因的前面或后面而誘導(dǎo)tRNA的再使用的方式。但預(yù)測到，在沒有另外的標記 的幫助的情況下，即使利用將目標基因的前面或后面的密碼子置換成稀有密碼子的方法， tRNA的再使用也顯示出相同的效果。這是因為可以預(yù)測到，特別是在稀有密碼子聚集于基 因0RF的中間或后面的情況下，出現(xiàn)在前面的密碼子與出現(xiàn)在后面的密碼子雖然確定同種 氨基酸，但是如果置換成稀有密碼子，則遠離融合于N-末端的RAMP標記而補償效果減少的 結(jié)果。根據(jù)這樣的假說，將最初出現(xiàn)的同義密碼子（synonymouscodon)置換成最后出現(xiàn)的 稀有密碼子。例如可觀察到，在酯酶1767的情況下，在起始密碼子ATG之后，基因的稀有密 碼子的同義密碼子（synonymouscodon)(以下劃線表示）間斷出現(xiàn)。如果將這樣的密碼子 ATT、GGT、CTT、CGT分別置換成ATA、GGA、CTA、CGA，則在氨基酸沒有發(fā)生變化的同時本身能 夠作為RAMP標記發(fā)揮作用。
[0130]例）ATG GTG CAG ATT CAG GGT CAT TAC GAA CTT CAG TTC GAA GCGGTA CGT(序 列4)
[0131] 實驗結(jié)果證明，關(guān)于RAMP標記的功能，不僅在采用配置于0RF的前面或后面的方 法時有效果，而且在將基因內(nèi)部前后8-12個序列更換為出現(xiàn)于基因中下端部的稀有密碼 子的同義密碼子（synonymouscodon)而使用時也有效果。作為通過與SDS-PAGE進行活性 比較的定量結(jié)果，確認到表達量增加2. 8-4. 7倍程度。
[0132][實施例11]對于細胞因子或激素蛋白質(zhì)的RAMP標記效果
[0133] 本實施例中，將RAMP標記的功能性應(yīng)用于附加價值高的難表達細胞因子蛋白質(zhì)。 細胞因子蛋白質(zhì)白細胞介素-1 (interleukin-1)和白細胞介素-32 (interleukin-32)雖然 作為免疫反應(yīng)和治療癌候選物質(zhì)應(yīng)用可能性很大，但是表達本身不進行，或者即使誘導(dǎo)了 表達，也因形成了包涵體（inclusionbody)而難以大量生產(chǎn)確保功能性的蛋白質(zhì)。包涵體 (IB)是指由宿主細胞中表達的外源蛋白質(zhì)的集聚現(xiàn)象引起的不溶性蛋白質(zhì)聚集體，其在蛋 白質(zhì)沒有正確折疊（folding)時生成。這樣的IB不僅使酶活性減少，而且對細胞生長誘發(fā) 應(yīng)激，因此減少IB的形成來提高可溶性（soluble)蛋白質(zhì)的生成比率在重組蛋白質(zhì)實際生 產(chǎn)中會成為重要的指標。在本實施例中，對表達率和可溶性低的細胞因子蛋白質(zhì)應(yīng)用RAMP 標記后確認了效果。通過蛋白質(zhì)印跡驗證了由于表達率低于相對一般的過表達蛋白質(zhì)而 難以區(qū)分的目標條帶的區(qū)分和表達量差異。這些蛋白質(zhì)的表達誘導(dǎo)中所利用的RAMP標記 的序列如下表9所示。白細胞介素-1基因使用了人類來源的基因（hIL-10)和小鼠來源 的基因（mlLlP)，使用了應(yīng)用以往蛋白質(zhì)過表達邏輯的密碼子優(yōu)化的合成基因（sILlP和 smlLlP，市場上訂購合成）作為對照組。在白細胞介素-32基因的情況下，由于稀有密碼 子大量存在，因此制作了 2個RAMP標記。
[0134] 表9.細胞因子蛋白質(zhì)基因表達用RAMP標記序列
[0135]
[0136] 結(jié)果觀察到，利用SDS-PAGE將白細胞介素-1的蛋白質(zhì)表達量與對照組進行比較 時，融合有標記的IL-l(R_hIL-10、R-sILlP、R-mIL10、R-smIL10)的總蛋白質(zhì)量增加 3. 7-6. 7倍以上（圖12)。如圖所示，未檢測出應(yīng)用了以往過表達邏輯的密碼子優(yōu)化基因 的表達。通過蛋白質(zhì)印跡，分析應(yīng)用了RAMP標記的白細胞介素-32(interleukin-32)的 表達率，結(jié)果可以確認到，與對照組相比，融合有RAMP標記的IL-32 (R-IL32 、R1-IL32y、 R2-IL32y)的總蛋白質(zhì)量增加2. 4-5. 5倍以上?？扇苄缘鞍踪|(zhì)量也增加2. 3-3. 8倍以上 (圖13)。此外，應(yīng)用于一個目標基因的兩個RAMP標記均確認到蛋白質(zhì)過表達，從而本發(fā)明 提供針對目標蛋白質(zhì)的RAMP標記的多種融合方法，由此顯示可以將RAMP標記序列以多種 順序組合而利用。
[0137] 由上述結(jié)果所示，判斷出在將能夠以特定基因的過表達邏輯充分利用的RAMP標 記向通用性大的通用標記（universaltag)擴展功能時，需要調(diào)節(jié)標記序列的位置或長度， 并為了獲得更有效的結(jié)果，需要翻譯偶聯(lián)技術(shù)（translationalcoupling)，即需要在一個 轉(zhuǎn)錄物中標記與基因不融合而獨立地進行翻譯。由此，在RAMP標記與基因之間，插入終止 密碼子（stopcodon)或者終止密碼子（stopcodon)和核糖體結(jié)合位點（RBS)，嘗試如下翻 譯偶聯(lián)技術(shù)。
[0138][實施例12]進行翻譯偶聯(lián)（translationalcoupling)的標記的功能性分析
[0139] 為了不以RAMP標記（ramptag)和重組蛋白質(zhì)融合的形態(tài)翻譯而僅使標記翻譯 成獨立的肽，在RAMP標記末端連接終止密碼子和核糖體結(jié)合位點（RBS)而制作引物。此 時，如果僅用1-2個堿基連接RAMP標記與目標基因之間距離，則可以在不導(dǎo)入核糖體結(jié) 合位點的情況下也獨立地誘導(dǎo)翻譯。如圖2所示那樣制作結(jié)構(gòu)體，并在誘導(dǎo)表達載體中 分析表達量。此時使用的目標蛋白質(zhì)是難表達酯酶（esterase，1767)和葡萄糖苷酶 (0 -glucosidase，SmGlu)，利用實施例7中使用的RAMP標記，并驗證效果。其結(jié)果與如圖 8所示的結(jié)果類似地可以確認到，在嫁接標記的1767的情況下，盡管誘導(dǎo)翻譯偶聯(lián)，但維持 高的蛋白質(zhì)量。然而在SmGlu的情況下，蛋白質(zhì)表達量相對減少而效果顯著，但用于誘導(dǎo)具 有更加一致性的結(jié)果的標記的獨立表達策略還有改善余地。這樣的問題與如下問題有關(guān)： 翻譯標記的核糖體直接參與目標基因的表達的效率低或者發(fā)生相互沖突（翻譯標記的核 糖體與翻譯基因的核糖體之間的干擾）。即，通過對照組實驗，確認到并非是標記的效能性 問題。
[0140][實施例13]同時使用商業(yè)化標記和RAMP標記的效果分析
[0141] 在本實施例中，提供將