一種高純度重組人腦利鈉肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別設(shè)及一種高純度重組人腦利鋼膚的制備方法，本 發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及用于制備重組人腦利鋼膚的易于高效表達(dá)的融合標(biāo)簽蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦利鋼膚化rainnatriureticP巧tide,BNP)又稱B型利鋼膚度-type natriureticpeptide,BNP)，是繼屯、鋼膚（ANP)后利鋼膚系統(tǒng)的又一成員，于1988年首先 在豬腦中被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)腦利鋼膚主要在屯、室屯、肌中合成并分泌，可W促進(jìn)排鋼、 排尿，舒張血管，具有較強(qiáng)的抗血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，并能對(duì)抗腎素一血 管緊張素一醒固酬系統(tǒng)（RAA巧的縮血管作用，對(duì)人體水和電解質(zhì)的平衡，屯、血管、內(nèi)分泌 系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著重要作用。
[0003] 人腦利鋼膚是由32個(gè)氨基酸組成的多膚片段，分子量約為3. 4kDa，在屯、肌細(xì)胞 內(nèi)首先合成其激素原前體，經(jīng)裂解去除一個(gè)26氨基酸的信號(hào)膚，化含108氨基酸的激素前 體proBNP形式分泌至細(xì)胞內(nèi)，并裂解成為無活性的N末端（NT-BN巧和有活性的BNP(含 32個(gè)氨基酸的C端片段）。2001年8月美國(guó)SCI0S公司生產(chǎn)的基因重組人腦利鋼膚 (recombinanthumanBNP，rhBNP)-Nesiritide上市，成為新一代靜脈注射用治療失代償性 屯、力衰竭的藥物。2005年，中國(guó)成都諾迪康生物制藥有限公司研制的治療用生物制品1類 新藥，重組人腦利鋼膚上市，商品名：新活素。用于患有休息或者輕微活動(dòng)時(shí)呼吸困難的急 性失代償性屯、力衰竭患者靜脈治療，按紐約核屯、協(xié)會(huì)（NYHA)分級(jí)大于II級(jí)。
[0004] 腦利鋼膚的制備主要有化學(xué)合成法和基因工程法，其中化學(xué)合成腦利鋼膚成本 高、價(jià)格昂貴，產(chǎn)業(yè)化困難。用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人腦利鋼膚是解決運(yùn)個(gè)問題的有效途 徑。常規(guī)大腸桿菌表達(dá)外源蛋白常會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白在胞內(nèi)積累而限制其表達(dá)量。大都在胞 內(nèi)積累，易形成包涵體。包涵體復(fù)性過程復(fù)雜，技術(shù)難度大，得率低，生產(chǎn)成本高，往往不能 應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。另外，多膚因其分子小，直接表達(dá)存在困難，一般需要采用融合表達(dá)技 術(shù)。目前研究采用的融合表達(dá)分為自身串聯(lián)融合表達(dá)和與其它載體蛋白融合表達(dá)兩種。如 果融合標(biāo)簽選擇不當(dāng)，仍不能實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)，且表達(dá)量不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備重組人腦利鋼膚的易于高效表達(dá)的融合標(biāo) 簽蛋白，該融合標(biāo)簽蛋白包括來源于大腸桿菌化sB或其片段，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2 所示，其核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示。該融合標(biāo)簽蛋白還包括：轉(zhuǎn)錄終止抗終止因子 (NusA)，或者大腸桿菌硫氧還蛋白AarxA)，或者二硫鍵氧化還原酶值sbA、化bC)，或者谷 脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶（GST)。所述融合標(biāo)簽蛋白能促進(jìn)重組人腦利鋼膚的可溶高效表達(dá)，且不 影響重組人腦利鋼膚的生物活性。
[0006] 包含重組人腦利鋼膚的融合蛋白，上述融合標(biāo)簽蛋白通過包含酶切位點(diǎn)的接頭融 合至所述人腦利鋼膚的N端，重組人腦利鋼膚的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.4所 示，其核巧酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0007] 所述接頭還包含柔性連接膚-(GG巧n-、組氨酸標(biāo)簽或其組合，所述柔性連接膚的 氨基酸序列為-HHHH皿GGS孤孤K-。
[0008] 本發(fā)明還提供一種優(yōu)化重組人腦利鋼膚的核酸分子，該核酸分子的核巧酸序列如 沈QIDNO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明還提供一種用于表達(dá)重組人腦利鋼膚的融合蛋白的載體，所述表達(dá)載體為 pET系列載體，優(yōu)選祀T-28a-c(+)，或者祀T29a，或者祀T-30a-c(+)，或者祀T39b(+)，或者 pET-40b(+)，或者祀T-41a(+)，或者祀T-43.la(+)。
[0010] 本發(fā)明還提供一種宿主菌，該宿主菌其能夠表達(dá)包含上述融合標(biāo)簽和重組人腦利 鋼膚的融合蛋白。該宿主菌為細(xì)菌或真菌，優(yōu)選地為大腸桿菌，該大腸桿菌為化21 0E3)，或 者化21 0E3)PlysS，或者TB1，較好的是大腸桿菌為化21 0E3)。
[0011] 重組人腦利鋼膚的制備方法，包括如下步驟：
[0012] 1)上述的融合標(biāo)簽蛋白通過包含酶切位點(diǎn)的接頭融合至核巧酸序列如SEQID NO:1所示的人腦利鋼膚的N端，得到融合蛋白核酸序列；
[0013] 2)將步驟1)所獲得的核酸序列克隆至表達(dá)載體構(gòu)建重組載體；
[0014] 3)培養(yǎng)能夠表達(dá)權(quán)利要求3所述的融合蛋白的宿主菌，將步驟2)所述的重組載體 用化學(xué)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)化至宿主菌.
[0015] 4)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的宿主菌表達(dá)重組人腦利鋼膚；
[0016]5)純化重組人腦利鋼膚。
[0017] 步驟3)所述的表達(dá)是將步驟3)所述的融合蛋白被分泌到宿主菌的周質(zhì)空間或者 在宿主細(xì)胞的胞內(nèi)表達(dá)。
[0018] 步驟5)所述的純化是從所述宿主菌的培養(yǎng)物中回收權(quán)利要求3所述的融合蛋白， 對(duì)回收的融合蛋白進(jìn)行酶切，并從酶切產(chǎn)物中回收重組人腦利鋼膚。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 通過接頭將融合標(biāo)簽融合至人腦利鋼膚N端形成融合蛋白，進(jìn)行融合表達(dá)，利用 純化手段將產(chǎn)物完全分離，實(shí)現(xiàn)了腦利鋼膚的可溶、高效表達(dá)。
[0021] 通過接頭序列-HHHH皿GGS孤孤K-實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)，其包含柔性連接膚-(GG巧n-，使 得融合標(biāo)簽未對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生影響，產(chǎn)物具有生物活性；包含組氨酸標(biāo)簽，利于純化， 提高收率；包含腸激酶位點(diǎn)-孤孤K-，使得融合標(biāo)簽被有效去除，最終獲得的重組人腦利鋼 膚的N端序列與天然序列完全一致。
[0022] 對(duì)編碼人腦利鋼膚的核巧酸序列進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)選擇的融合標(biāo)簽為可W在宿主細(xì) 胞，尤其是大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)的化sB或其片段，使得重組人腦利鋼膚高效、可溶表 達(dá)。
[0023] 利用本發(fā)明的方法制備重組人腦利鋼膚融合蛋白為可溶表達(dá)，表達(dá)量大于菌體總 蛋白的20 %。最終重組人腦利鋼膚得率為lOOmg純品/L發(fā)酵液，純度大于96 %，生物活性 與陽(yáng)性對(duì)照藥物一致，內(nèi)毒素小于祀U(xiǎn)/mg。制備的重組人腦利鋼膚，用于治療急性失代償屯、 力衰竭。
[0024] 本發(fā)明利用大腸桿菌化sB作為融合標(biāo)簽，可高效促進(jìn)hBNP可溶表達(dá)，避免了包涵 體復(fù)性，降低生產(chǎn)成本，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處說描述的具體實(shí)施例僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒祀T30-a(+)-hBNP的結(jié)構(gòu)圖；
[0027] 圖2為本發(fā)明構(gòu)建的祀T30-a(+)-hBNP/BL21 〇)E3)工程菌搖瓶誘導(dǎo)篩選結(jié)果；
[0028] 圖3為RP-HPLC檢測(cè)結(jié)果，純度大于98%;
[0029] 圖4為rhBNPN端氨基酸序列檢測(cè)結(jié)果；
[0030] 圖5-1、5-2為rhBNP高分辨率質(zhì)譜分子量檢測(cè)結(jié)果；
[0031] 圖6-1、6-2、6-3為rhBNP二硫鍵鑒定結(jié)果；
[0032] 圖7為rhBNP生物活性測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1重組人腦利鋼膚融合蛋白工程菌構(gòu)建
[0034] 1、祀T30-a(+)-hBNP/BL2UDE3)工程菌構(gòu)建
[0035] 人腦利鋼膚成熟蛋白序列（GenBank登錄號(hào)：NP_002512. 1)為32個(gè)氨基酸，人腦 利鋼膚基因序列如SEQIDNO. 1所示。
[0036] 標(biāo)簽蛋白選取來源于大腸桿菌化sB全序列（GenBank登錄號(hào)：BAA15575. 2);所述 融合標(biāo)簽蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示，其核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0037] 設(shè)計(jì)街頭序列為-HHHH皿GGS孤孤K-、對(duì)應(yīng)的核酸序列為CACCATCATCATCATCATGGT GGTTCTGACGACGACGACAAG作為接頭，通過接頭將上述化sB標(biāo)簽蛋白C端與人腦利鋼膚成熟 蛋白序列N端連接，所獲融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 4所不，該融合蛋白的核酸序 列如沈QIDNO. 5所示。
[0038] 將設(shè)計(jì)的融合蛋白核酸序列（SEQIDNO. 5)委托南京金斯瑞生物科技有限公司 進(jìn)行全基因合成，并通過Ndel/Notl位點(diǎn)亞克隆至表達(dá)載體，其載體選自商業(yè)化（即市 售，下同）載體祀T-28a-c(+)，或者祀T29a，或者祀T-30a-c(+)，或者祀T39b(+)，或者 pET-4化(+)，或者祀T-41a(+)，或者祀T-43.la(+)，載體的宿主細(xì)胞為細(xì)菌或真菌，所述宿 主細(xì)胞為大腸桿菌，選自商業(yè)化菌株化21 0E3)，或者化21 0E3)PlysS，或者TB1。本實(shí)施例 采用大腸桿菌表達(dá)載體祀T30-a(+)，構(gòu)建獲得表達(dá)載體祀T30-a(+)-hBNP，構(gòu)建示意圖如 圖1所示。
[0039]將構(gòu)建的表達(dá)載體用化學(xué)轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主菌化21值E3)，利用 LB+kan固體平板篩選，獲得重組表達(dá)工程菌祀T30-a(+)-hBNP/BL21 〇)E3)。
[0040] 2、工程菌誘導(dǎo)篩選
[0041] 隨機(jī)挑取上述祀T30-a(+) -hBNP/BL21 〇)E3)工程菌接種至10mlLB培養(yǎng)基 (lOOug/mlkan)，100ml錐形瓶培養(yǎng)，37°C22化pm搖床培養(yǎng)過夜。第二天取過夜培養(yǎng)的母液 按1 %比例轉(zhuǎn)接于40mlLB液體培養(yǎng)基（lOOug/mlkan)，在250ml錐形瓶中，37°C，220;