rpm 培養(yǎng)2. 5h，至ODe。。值約0. 6-1. 0。加入終濃度ImMIPTG，30°C誘導4h。
[0042] 805斗466電泳檢測，結果如圖2所示，泳道1-6:祀130-曰(+)-118^/81^21值63)1-6 號誘導地總蛋白；對照：未誘導總蛋白；泳道M:蛋白質(zhì)分子量Marker。與對照比較，在理 論分子量20kD處6株工程菌實現(xiàn)特異表達，表達量占菌體總蛋白20%W上。對誘導表達菌 體進行破菌分析，表明全部實現(xiàn)可溶表達。
[0043] 實施例2重組人腦利鋼膚工程菌發(fā)酵
[0044] 將祀T30-a(+) -hBNP/BL21 〇)E3)工程菌劃線LB平板化anlOOmg/L)，37°C恒溫培 養(yǎng)箱培養(yǎng)約16-1化，至單菌落長出。挑工程菌單菌落接種20mlLB培養(yǎng)基中化anlOOmg/ L)，37°C，230巧m培養(yǎng)8h。0. 1%轉接至 250mlLB化an100mg/L)aL錐形瓶，37°C，230巧m培 養(yǎng)13h。平行培養(yǎng)4瓶，制備菌液100〇1111，5%接種至發(fā)酵罐化。-222化發(fā)酵培養(yǎng)基中燈6 培養(yǎng)基），接種前用氨水將抑調(diào)至7. 0,發(fā)酵過程控制溫度為36°C。發(fā)酵培養(yǎng)基的抑值和 溶氧通過流加氨水和增加攬拌速度和通氣量來控制，溶氧大余30 %。約化后培養(yǎng)基中的 碳源耗盡，ODe。。達到20，之后W240mLA/2化培養(yǎng)基的速度開始流加補料培養(yǎng)基（40 %甘油 +20%酵母粉）繼續(xù)培養(yǎng)，0的。。達到35，^601111711/2化培養(yǎng)基的速度流加補料培養(yǎng)基開始 誘導，誘導劑為異丙基-P-D-硫代半乳糖巧（IPTG，鼎國生物），終濃度ImM。并保持此流加 速度，維持DO在30%W上。誘導地，下罐。
[0045] 離屯、收集菌體，將菌體懸浮在破菌緩沖液中（25mmTris-HCl，150mmNaCl，P冊.0)， 高壓勻漿破菌，將破碎液離屯、，收集上清液，棄沉淀。
[0046] 實施例3重組人腦利鋼膚分離純化
[0047] 將破菌液上清上樣于經(jīng)0. 2MNiS04處理并W20mMTris-HCl(P冊.0)平衡的 化2+-QielatingSe地aroseFastFlow(GEHealthcare)馨合層析介質(zhì)，W200mM咪挫（含 20mM化is-肥1，P冊.0)洗脫；收集的目的融合蛋白經(jīng)脫鹽處理，按每Img融合蛋白加入 0.抓腸激酶巧OmMTris-肥l，2mMCaC12,0. 1%Tween-20,P冊.0)在6-8°C條件下酶切融 合蛋白約17h。
[0048] 酶切目的蛋白上樣于Ni2+-QielatingSe地aroseFastFlow,目的蛋白和融合標 簽同時掛柱。但目的蛋白掛柱結合力低，用50mM濃度咪挫（上海生工，批號：B421BA0025) 洗脫目的蛋白，收集洗脫蛋白峰。再經(jīng)過CMFF精純化獲得高純度目的蛋白。SDS-PAGE檢測 分子量約20kD，純度大于95%，HPLC分析純度大于98%，見圖3。 W例實施例4重組人腦利鋼理化性質(zhì)測定
[0050] 1、N末端氨基酸序列測定
[0051] 將上述方法制備得到的riiBNP，進行N末端氨基酸序列測定，測定結果經(jīng)中國科學 院上海生命科學研究院檢測與天然BNP成熟蛋白N端序列一致，見圖4。
[0052] 2、質(zhì)譜分子量
[0053] 將上述方法制備得到的rhBNP，進行高分辨質(zhì)譜分析，委托中國科學院上海生命科 學研究院測定分子量為3461. 7,與理論分子量一致，見圖5-1、5-2。
[0054] 3、二硫鍵鑒定 陽化5] 上述方法制備得到的riiBNP，進行二硫鍵鑒定，委托中國科學院上海生命科學研究 院完成。檢測結果表明分子內(nèi)有一對二硫鍵，與理論配對位置一致，見圖6-1、6-2、6-3。
[0056] 實施例5重組人腦利鋼膚生物活性測定
[0057] 1、離體動脈條法
[0058] 該方法使用離體主動脈條直接觀察重組人腦利鋼膚（riiBN巧的舒張血管效應，最 能夠真實有效地反映藥物臨床藥理效用。
[0059] 2、實驗方法
[0060] 用去氧腎上腺素（國家標準物質(zhì)ID :V5LW-03RV)使離體兔動脈條收縮，然后使用 由低到高的系列rhBNP濃度的溶液松弛動脈條，用張力感應器記錄張力變化。
[0061] 2. 1兔離體動脈條制備與平衡
[0062] 取1. 5~2. 5kg新西蘭大白兔，麻醉狀態(tài)下取胸主動脈降支，剪成長約1. 5cm，寬 約2~3mm的動脈條，懸掛于含通氧的37°C臺氏液的麥氏浴槽中，加Ig前負荷平衡1-化， 期間每20min換1次臺氏液，連接多導聯(lián)生理記錄儀，監(jiān)測離體動脈條的張力變化，待張力 穩(wěn)定。
[0063] 2. 2兔離體動脈條測定
[0064] 2. 2. 1在臺氏液中加入去氧腎上腺素溶液使張力上升，待保持穩(wěn)定后，加入陽性 對照藥物"新活素"。"新活素"由成都諾迪康生物制藥有限公司生產(chǎn)，批號：20131201。加 入"新活素"使其終濃度依次為：〇. 3125,0. 625,1. 25,2. 5,5，10,20,40,80，160,320,640， 1280, 2560ng/血。按照W上濃度從低到高依次加入陽性對照藥，每一濃度張力穩(wěn)定后再加 入下一濃度藥物，W此類推記錄離體動脈條的張力變化，計算"新活素"半效濃度。
[00化]2.2.2繼續(xù)每20min換1次臺氏液，平衡化，其間監(jiān)測離體動脈條的張力變化，待 張力穩(wěn)定后，用2. 2. 1同法檢測供試品rhBNP溶液。
[0066] 2. 2. 3數(shù)據(jù)處理
[0067] 用Graph PrismS. 0軟件計算舒張度EC50和半效稀釋倍數(shù)，W下式計算：
[0068]
[0069] 式中Pr為標準品生物學活性，U/ml;
[0070] 化為供試品預稀釋倍數(shù)；
[0071] 化為標準品預稀釋倍數(shù)；
[0072]Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；
[0073] 化為標準品半效量的稀釋倍數(shù)。
[0074] 3、實驗結果
[0075] W已上市藥物"新活素"作為陽性對照，本發(fā)明制備的rhBNP生物活性與已上市藥 物相當，見圖7。
[0076] 盡管本發(fā)明的【具體實施方式】已經(jīng)得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可W對那些細節(jié)進行各種修改和替換，運些改變均在本發(fā)明的保 護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
【主權項】
1. 一種用于制備重組人腦利鈉肽的易于高效和可溶表達的融合標簽蛋白，其特征在 于：包括來源于大腸桿菌MrsB或其片段，該融合標簽蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所 示，其核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。2. 根據(jù)權利要求1所述的融合標簽蛋白，其特征在于：所述融合標簽蛋白還包括：轉 錄終止抗終止因子（NusA)，或者大腸桿菌硫氧還蛋白A(TrxA)，或者二硫鍵氧化還原酶 (DsbA、DsbC)，或者谷胱甘肽S-轉移酶（GST)。3. 包含重組人腦利鈉肽的融合蛋白，其特征在于，權利要求1所述的融合標簽通過包 含酶切位點的接頭融合至所述人腦利鈉肽的N端，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 4所示，其核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示。4. 根據(jù)權利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：所述接頭還包含柔性連接肽-(GGS) n-、組氨酸標簽或其組合。5. 根據(jù)權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：所述柔性連接肽的氨基酸序列 為-HHHHHHGGSDDDDK-。6. -種表達載體，其特征在于：包含編碼權利要求3所述核酸序列。7. 根據(jù)權利要求6表達載體，其特征在于：所述表達載體為pET系列載體，優(yōu)選pET-28a-c(+)，或者pET29a，或者pET-30a-c(+)，或者pET39b(+)，或者pET-40b(+)，或者 pET-41a(+)，或者pET-43.Ia(+)。8. -種表達如權利要求6或7所述表達載體的宿主菌。9. 根據(jù)權利要求8所述的宿主菌，其特征在于：該宿主菌為細菌或真菌，優(yōu)選地為大腸 桿菌，該大腸桿菌為BL21 (DE3)，或者BL21 (DE3)PlysS，或者TBl。10. 重組人腦利鈉肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 權利要求1所述的融合標簽蛋白通過包含酶切位點的接頭融合至核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的人腦利鈉肽的N端，得到融合蛋白核酸序列； 2) 將步驟1)所獲得的核酸序列克隆至表達載體構建重組載體； 3) 培養(yǎng)能夠表達權利要求3所述的融合蛋白的宿主菌，將步驟2)所述的重組載體用化 學轉染法轉化至宿主菌； 4) 誘導轉化后的宿主菌表達重組人腦利鈉肽； 5) 純化重組人腦利鈉肽。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高純度重組人腦利鈉肽(hBNP)的制備方法，該制備方法包括優(yōu)化人成熟腦利鈉肽的編碼基因，通過接頭在其編碼的成熟腦利鈉肽N端融合一個在大腸桿菌中易于高效表達的融合標簽。本發(fā)明還提供了包含編碼上述融合蛋白的核酸的表達載體、包含所述表達載體的工程菌，以及利用該工程菌制備重組人腦利鈉肽的方法。本發(fā)明所述方法制備的重組人腦利鈉肽具有與天然蛋白相同的生物活性，純度高，成本低等優(yōu)點。
【IPC分類】C07K19/00, C07K14/58, C12N1/21, C07K14/245, C12N15/70
【公開號】CN105198972
【申請?zhí)枴緾N201510625028
【發(fā)明人】李樹剛, 張偉, 辛渝, 龔會英, 但國平, 柴新娟, 王勇, 劉新, 于廷和
【申請人】重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月28日