一種卵巢癌干細(xì)胞疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及分子生物學(xué)和基因工程。
【背景技術(shù)】
[0002]上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, E0C)約占卵巢癌的90%，是女性生殖器常見腫瘤，其發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位，但死亡率卻占各類婦科腫瘤的首位。關(guān)于卵巢癌的發(fā)生機制，有報道認(rèn)為是由于排卵后的炎癥和/或損傷修復(fù)，以及在修復(fù)過程中所產(chǎn)生的干細(xì)胞異常增殖，但是目前尚無定論。因此，探明卵巢癌發(fā)生的起因，針對病因進行有針對性治療，尤其抑制EOC的生長和轉(zhuǎn)移，進而清除EOC以及EOC腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)，才能從根本上治愈卵巢癌。
[0003]目前針對卵巢癌的常規(guī)治療是手術(shù)切除，輔以順鉑/紫杉醇化療，該治療方案在原發(fā)卵巢癌患者的完全緩解率可達(dá)70%，然而大部分患者在18個月內(nèi)復(fù)發(fā)，殘存的癌細(xì)胞對化療藥轉(zhuǎn)為耐受型細(xì)胞，現(xiàn)有的治療方案尚不能達(dá)到有效緩解的治療效果?？梢姡殉舶┮殉蔀榕詯盒阅[瘤中的“無聲殺手”，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅。
[0004]干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制、更新功能和多向分化潛能的原始未分化細(xì)胞，分為胚胎干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。而CSCs是指腫瘤組織中具有高致瘤性、自我更新及分化能力等干細(xì)胞性質(zhì)的癌細(xì)胞亞群，是形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞和腫瘤不斷增殖的根源。CSCs學(xué)說主要為腫瘤細(xì)胞間存在異質(zhì)性，其中一小群具有自我更新、無限增殖能力和不定分化潛能，是腫瘤形成的起始細(xì)胞并維持腫瘤的生長；CSCs對放療、化療不敏感，可能是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源。針對CSCs的靶向治療，消滅腫瘤的“種子”細(xì)胞即CSCs，只有這樣方能取得較理想的療效。
[0005]用CSCs制備成以腫瘤干細(xì)胞(TSC)瘤苗可以誘導(dǎo)針對CSCs的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。有研究者應(yīng)用乙醛脫氫酶(ALDH)作為TSC標(biāo)記，從小鼠黑色素瘤D5細(xì)胞系和鱗癌SCC7細(xì)胞系中分選出富含TSC的細(xì)胞群，制備成細(xì)胞裂解物，負(fù)載DCs后，作為腫瘤疫苗，分別免疫相應(yīng)的C57BL/6小鼠和C3H小鼠。相較應(yīng)用未經(jīng)分選的全細(xì)胞裂解物負(fù)載DCs作為腫瘤疫苗接種的小鼠，前一方法在兩種腫瘤模型中均誘導(dǎo)出了更為明顯的腫瘤特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且其脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和GM-CSF較后一方案更高。還有學(xué)者研發(fā)出CD133特異性表位疫苗，CD133是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TSC的分子標(biāo)志，該分子的兩個HLA 限制性表位 ILSAFSVYV(CD133-405)和 YLQWIEFSI (CD133-753)能結(jié)合 HLA_A*0201 分子。以⑶133-405或⑶133-753短肽負(fù)載DCs作為腫瘤疫苗，誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性⑶8+CTL能夠識別并裂解CD133+HLA-A*0201 (+)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TSC。該項研究成果支持應(yīng)用CD133特異性表位疫苗靶向TSC，用以防治多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
[0006]本發(fā)明以⑶117及⑶44為EOC CSCs的特異性標(biāo)記篩選出CSCs進行卵巢癌干細(xì)胞疫苗研究。因CD117是由c-kit原癌基因編碼的跨膜蛋白受體，其配體為干細(xì)胞生長因子(stem cell growth factor, SCF) 0 SCF是重要的造血生長因子，SCF-CD117相互作用可刺激造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化，對腫瘤細(xì)胞可能有刺激生長作用。CD44分子是一種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，屬于黏附分子，廣泛分布于造血系統(tǒng)、上皮系統(tǒng)、內(nèi)皮系統(tǒng)和中胚層來源的細(xì)胞上。研究表明，CD44與腫瘤的增殖、迀移、侵襲和腫瘤相關(guān)的血管生成密切相關(guān)，并且⑶44基因是CSCs表型的重要標(biāo)志物之一。⑶44分為兩類:僅由組成型外顯子編碼而成，稱為標(biāo)準(zhǔn)型CD44，廣泛存在于各組織內(nèi)，與透明質(zhì)酸結(jié)合，參與細(xì)胞及細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附作用過程，對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用；由含有V區(qū)變異型外顯子編碼而成CD44分子，稱變異型CD44，CD44變構(gòu)體表達(dá)水平的變化與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CD44蛋白參與細(xì)胞間的黏附、淋巴細(xì)胞的活化、介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢或再循環(huán)及細(xì)胞的運動、細(xì)胞內(nèi)外的信號傳導(dǎo)及凋亡等生理過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種卵巢癌干細(xì)胞疫苗及其制備方法。
[0008]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種卵巢癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，
[0009](I)獲取準(zhǔn)備卵巢癌細(xì)胞，進行傳代培養(yǎng)，以10%胎牛血清的RPMI1640為培養(yǎng)基，37°C、5% 0)2飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞長至一定密度，胰酶消化吹散后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)；
[0010](2)取免疫磁珠分選MACS緩沖液懸浮卵巢癌細(xì)胞?’每I X 17?I X 10 8卵巢癌細(xì)胞，加入100 μ I FcR阻斷劑，混勻后4°C孵育30min ；
[0011](3)每IX 17?I X 10 8細(xì)卵巢癌胞，加入⑶44+磁珠標(biāo)記的直標(biāo)單克隆抗體，混勻后4°C孵育一段時間，之后加PBS洗滌后離心，棄上清，將細(xì)胞沉淀重復(fù)PBS洗滌2-4次；
[0012](4)取免疫磁珠分選MACS用緩沖液懸浮卵巢癌細(xì)胞，
[0013](5)把分離柱放入磁場中，加入緩沖液平衡分離柱后；加入步驟(4)的細(xì)胞懸液，稍后加入緩沖液沖洗收集陰性細(xì)胞(CD44-卵巢癌細(xì)胞)；
[0014](6)將分離柱移出磁場，放于一個合適的收集試管上，用少量緩沖液勻速沖洗，收集陽性細(xì)胞(CD44+卵巢癌細(xì)胞)；
[0015](7)取免疫磁珠分選MACS用緩沖液懸浮分選步驟(6)得到的⑶44+卵巢癌細(xì)胞，過夜培養(yǎng)48h ;
[0016](8)每IX 17?IX 10 8細(xì)胞，加入100 μ I FcR阻斷劑，混勻后4°C孵育30min ;
[0017](9)每I X 17?I X 108細(xì)胞，加入CD 117+磁珠標(biāo)記的直標(biāo)單克隆抗體，混勻后4 V孵育一段時間，之后加PBS洗滌后離心，棄上清，將細(xì)胞沉淀重復(fù)PBS洗滌2-4次；
[0018](10)取免疫磁珠分選MACS用緩沖液懸浮卵巢癌細(xì)胞；
[0019](11)把分離柱放入磁場中，加入緩沖液平衡分離柱后；加入細(xì)胞懸液，稍后加入緩沖液沖洗收集陰性細(xì)胞(CDl 17-卵巢癌細(xì)胞)；
[0020](12)將分離柱移出磁場，放于一個合適的收集試管上，用少量緩沖液勻速沖洗，收集陽性細(xì)胞；
[0021](13)將分離柱移出磁場，放于一個合適的收集試管上，用少量緩沖液勻速沖洗，收集陽性細(xì)胞⑶117+卵巢癌細(xì)胞，即為⑶117+⑶44+卵巢癌細(xì)胞；
[0022](14)培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，48h內(nèi)制備卵巢癌干細(xì)胞疫苗。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟(14)具體如下:將CD117+CD44+卵巢癌干細(xì)胞用MIT，2 μ g/ml處理20-30h，滅活后作為卵巢癌干細(xì)胞疫苗。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟(14)具體如下:將CD117+CD44+卵巢癌干細(xì)胞用50 μ g/ml絲裂霉素C處理10-15h，滅活后作為卵巢癌干細(xì)胞疫苗。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟(14)具體如下:將CD117+CD44+卵巢癌干細(xì)胞用放射線滅活后作為卵巢癌干細(xì)胞疫苗。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述的卵巢癌干細(xì)胞來自人。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述的卵巢癌干細(xì)胞選自SK0V3細(xì)胞系或H08910細(xì)胞系。
[0028]本發(fā)明的第二方面提供一種前述方法制備得到的卵巢癌干細(xì)胞疫苗。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述的卵巢癌干細(xì)胞來自人。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述的卵巢癌干細(xì)胞系選自SK0V3細(xì)胞系或H08910細(xì)胞系。
[0031]本發(fā)明的第三方面提供一種前述卵巢癌干細(xì)胞疫苗在制備治療卵巢癌癥藥物中的應(yīng)用。
[0032]優(yōu)選地，卵巢癌干細(xì)胞疫苗在制備治療上皮性卵巢癌癥藥物中的應(yīng)用。
[0033]本發(fā)明的卵巢癌細(xì)胞來源包括:手術(shù)切除來源的自體腫瘤組織、切檢的自體腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、粗針穿刺活檢來源的自體腫瘤組織、癌性腹水中的腫瘤細(xì)胞。卵巢癌干細(xì)胞來源還包括來源于異體的卵巢癌細(xì)胞系和/或細(xì)胞株。
[0034]本發(fā)明中⑶117+⑶44+卵巢癌干細(xì)胞疫苗在動物實驗中能夠提高血清IFN- γ水平，下調(diào)TGF- β的表達(dá)，增強NK細(xì)胞活性，顯著降低⑶117+⑶44+卵巢癌干細(xì)胞數(shù)量，抑制腫瘤的生長。本發(fā)明中CD117+CD44+SK0V3細(xì)胞少量細(xì)胞致瘤實驗及無血清培養(yǎng)成球?qū)嶒灲Y(jié)果，說明⑶117+⑶44+SK0V3細(xì)胞具有CSCs的高致瘤性、自我更新及分化能力特性。
【附圖說明】
[0035]圖1是裸鼠卵巢癌模型中的⑶117+⑶44+干細(xì)胞疫苗的活性對比。圖1A為不同疫苗組小鼠接種SK0V3致瘤后47天后麻醉處死檢測各組腫瘤大體標(biāo)本，最長徑線多20mm ;圖1B為裸鼠致瘤后，各組腫瘤體積變化情況；圖1C為各組裸鼠接種SK0V3細(xì)胞后，無瘤生存時間曲線。