其中，四組為干細(xì)胞疫苗組、非干細(xì)胞疫苗組、SK0V3細(xì)胞疫苗組、PBS對照組。
[0036]圖2顯示裸鼠免疫接種SK0V3細(xì)胞后，麻醉處死前獲取裸鼠外周血，血清中IFN-γ, TGF-β含量檢測情況。其中，圖2Α為檢測各組裸鼠血清中IFN-γ含量:CSCvaccine 組相較于 non-CSC vaccine 組(ρ〈0.05)、SK0V3 細(xì)胞組(ρ〈0.01)和 PBS 組(ρ<0.001)具有明顯差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；圖2Β為各組裸鼠血清中TGF-β含量:CSC vaccine 組相較于 non-CSC vaccine 組(ρ〈0.05)、SK0V3 細(xì)胞組(ρ〈0.01)和 PBS 組(ρ〈0.001)具有明顯差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0037]圖3ΝΚ細(xì)胞毒性實驗:裸鼠麻醉處死后取脾獲得脾細(xì)胞懸液標(biāo)記CFSE作為效應(yīng)細(xì)胞，YAC-1作為靶細(xì)胞，在效靶比25:1條件下檢測CFSE陰性細(xì)胞群中7-AAD陽性細(xì)胞，即為被NK細(xì)胞毒性殺傷的細(xì)胞。圖3Α為不同疫苗組被NK細(xì)胞毒性殺傷的YAC-1細(xì)胞流式細(xì)胞峰圖；圖3Β為不同疫苗組被NK細(xì)胞毒性殺傷的YAC-1細(xì)胞柱狀圖，CSC vaccine組相較于 non-CSC vaccine 組(ρ〈0.05)、SK0V3 細(xì)胞組(ρ〈0.01)和 PBS 組(ρ〈0.001)具有明顯差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0038]圖4為不同疫苗免疫小鼠瘤組織細(xì)胞中⑶44+⑶117+CSC比例檢測。圖4A為.流式細(xì)胞散點圖！control組為小鼠腫瘤細(xì)胞未染色的空白對照，⑶44+⑶117+細(xì)胞比例0.217% WD44+⑶117+CSC疫苗組腫瘤細(xì)胞中CD44+CD117+細(xì)胞比例1.55 % ；non-CD44+CD117+CSC疫苗組腫瘤細(xì)胞中CD44+CD117+細(xì)胞比例2.43% ;SK0V3細(xì)胞疫苗組腫瘤細(xì)胞中CD44+CD117+細(xì)胞比例2.69% ;PBS組腫瘤細(xì)胞中CD44+CD117+細(xì)胞比例12.7% ;圖4B為.柱狀分析圖，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)⑶44+⑶117+CSC疫苗組的腫瘤細(xì)胞中CD44+CD117+ 細(xì)胞比例，與 control 組(ρ〈0.01)、non_CD44+CD 117+CSC 疫苗組(ρ〈0.05)、SK0V3細(xì)胞疫苗組(p〈0.01)、PBS組(p〈0.001)均有差異，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0039]圖5為不同疫苗免疫小鼠瘤組織細(xì)胞中ALDHhigh比例檢測。圖5A為流式細(xì)胞散點圖；左側(cè)縱列是同組加入ALDH抑制劑DEAB的陰性對照，Rl為ALDH活性高表達(dá)區(qū)域，右側(cè)縱列是未加抑制劑的陽性組，R2為ALDH活性高表達(dá)區(qū)域。各組ALDHhigh比例為同組R2-R1 數(shù)值；CD44+CD117+CSC 疫苗組 0.58% ;non_CD44+CD117+CSC 疫苗組 1.48%；SK0V3 細(xì)胞疫苗組1.60% ；PBS組10.4% ;
[0040]圖5B為柱狀分析圖；統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)CD44+CD117+CSC疫苗組的腫瘤細(xì)胞中ALDHhigh細(xì)胞比例，與 non-CD44+CD117+CSC 疫苗組(ρ〈0.05)、SK0V3 細(xì)胞疫苗組(ρ〈0.01)、PBS 組(ρ〈0.001)均有差異，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
【具體實施方式】
[0041]以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體應(yīng)用要求的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。材料和儀器
[0042]⑶117+磁珠標(biāo)記的直標(biāo)單克隆抗體，德國美天旎公司KD44+磁珠標(biāo)記的直標(biāo)單克隆抗體，德國美天旎公司；
[0043]人上皮卵巢癌細(xì)胞株SK0V3和上皮卵巢癌細(xì)胞株Η08910細(xì)胞系購于上海細(xì)胞所。
[0044]BALB/c裸鼠(5_6周齡)購自揚(yáng)州大學(xué)動物中心，許可號碼:SCXK。
[0045]流式細(xì)胞儀，美國BD公司。
[0046]實施例1卵巢癌細(xì)胞的制備
[0047]a、無菌獲取腫瘤組織后，用含雙抗的PBS清洗腫瘤組織，剔除壞死組織、結(jié)締組織、血管、脂肪等，用剪刀將腫瘤組織剪碎成Imm3的組織塊，加膠原酶、DNA酶，消化酶解，過濾、制備單細(xì)胞懸液；
[0048]b、應(yīng)用免疫磁珠分離出成纖維細(xì)胞；
[0049]C、經(jīng)陰選液置培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，去除懸浮細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)。
[0050]實施例2卵巢癌干細(xì)胞⑶117+⑶44+的制備
[0051]細(xì)胞培養(yǎng)及免疫磁珠分選
[0052]1.將人EOC SK0V3細(xì)胞以10%胎牛血清的RPMI1640為培養(yǎng)基，37°C、5% C02飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞長至一定密度，胰酶消化吹散后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
[0053]2.CD44+SK0V3 細(xì)胞的免疫磁珠分選(magnetic activated cell sorting, MACS)
[0054](I)取300 μ I MACS用的緩沖液懸浮SK0V3細(xì)胞；
[0055](2)每IX 17?1X10 8細(xì)胞，加入100 μ I FcR阻斷劑，混勻后4°C孵育30min ；
[0056]⑶每I X 17?I X 10 8細(xì)胞，加入100 μ I CD44+磁珠標(biāo)記的直標(biāo)單克隆抗體，混勻后4°C孵育30min，之后加PBS至lmL，100rmp離心8min留取細(xì)胞沉淀；
[0057](4)加入PBS (含EDTA)液至lmL，100rmp離心8min，洗滌細(xì)胞一次，棄上清，去除多余抗體，此步驟重復(fù)一次；
[0058](5)取300 μ I MACS用的緩沖液懸浮SK0V3細(xì)胞，進(jìn)入下一步；
[0059](6)把分離柱放入磁場中，加入500 μ I緩沖液，平衡分離柱；
[0060](7)加入細(xì)胞懸液，稍后加入1500 μ I緩沖液沖洗收集陰性細(xì)胞(⑶44-SK0V3細(xì)胞)；
[0061](8)將分離柱移出磁場，放于一個合適的收集試管上，用ImL緩沖液勻速沖洗，必要時要用栗加壓，收集陽性細(xì)胞(CD44+SK0V3細(xì)胞)。
[0062]3.CD117+CD44+SK0V3 細(xì)胞的免疫磁珠分選 MACS
[0063](I)取300 μ I MACS用的緩沖液懸浮分選后過夜培養(yǎng)48h⑶44+SK0V3細(xì)胞；
[0064](2)每I X 17?I X 10 8細(xì)胞，加入100 μ I FcR阻斷劑，混勻后4°C孵育30min ；
[0065](3)每I X 17?I X 10 8細(xì)胞，加入100 μ I CDl 17+磁珠標(biāo)記的直標(biāo)單克隆抗體，混勻后4°C孵育30min，之后加PBS至lmL，100rmp離心8min留取細(xì)胞沉淀；
[0066](4)加入PBS (含EDTA)液至lmL，100rmp離心8min，洗滌細(xì)胞一次，棄上清，去除多余抗體，此步驟重復(fù)一次；
[0067](5)取300 μ I MACS用的緩沖液懸浮SK0V3細(xì)胞，進(jìn)入下一步；
[0068](6)把分離柱放入磁場中，加入500 μ I緩沖液，平衡分離柱；
[0069](7)加入細(xì)胞懸液，稍后加入1500 μ I緩沖液沖洗收集陰性細(xì)胞(⑶117-SK0V3細(xì)胞)；
[0070](8)將分離柱移出磁場，放于一個合適的收集試管上，用ImL緩沖液勻速沖洗，必要時要用栗加壓，收集陽性細(xì)胞(⑶117+SK0V3細(xì)胞)，即為⑶117+⑶44+SK0V3細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，48h內(nèi)用于CSCs實驗。
[0071 ] 實施例3⑶117+⑶44+SK0V3細(xì)胞形態(tài)觀察及表面標(biāo)志檢測
[0072]倒置顯微鏡下，連續(xù)動態(tài)觀察細(xì)胞生長狀況，取體外培養(yǎng)⑶117+⑶44+SK0V3細(xì)胞I X 16個，分別用CD117-PE和CD44-FITC單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞，置37°C、飽和濕度、5% C02培養(yǎng)箱中孵育30min，PBS洗去多余抗體，F(xiàn)CM檢測⑶117+⑶44+SK0V3表面標(biāo)志。
[0073]實施例4
[0074]流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測分選的EOC⑶44+⑶117+細(xì)胞表面⑶44和⑶117分子表達(dá)
[0075](I) 800rpm離心5min收集I X 16MASC分選的經(jīng)過72h無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的⑶44+⑶117+細(xì)胞及常規(guī)培養(yǎng)的SK0V3細(xì)胞；
[0076](2) PBS 800rpm 離心 5min 洗滌 3 次，100 μ L PBS 重懸；5 μ L FcR 封閉液封閉30min，PBS 洗滌 3 次，每次 3min ；
[0077](3)每100 μ L反應(yīng)體系先后加入0.5 μ g FITC標(biāo)記的⑶44+單克隆抗體和5 μ LPE標(biāo)記的CDl 17+單克隆抗體，4°C孵育30min ;用PBS洗滌3次，每次3min，重懸于400 μ LPBS中；FCM檢測。設(shè)未加單抗的細(xì)胞為陰性對照。
[0078]實施例5裸鼠免疫建立流程
[0079]采用Balb/c裸鼠體內(nèi)實驗評價CS