述的實(shí)施例是示例性的，僅 用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0053] 實(shí)施例1與山羊角型相關(guān)的SNP標(biāo)記的獲得
[0054] 發(fā)明人通過(guò)RAD-seq及GWAS挖掘青山羊角型相關(guān)遺傳標(biāo)記，利用這些標(biāo)記可以提 高角型性狀選擇的準(zhǔn)確性。
[0055]1、青山羊血液樣品的采集和DNA的提取
[0056] 1)455個(gè)樣品均來(lái)自于山東翰龍羊業(yè)股份有限公司青山羊，其中76個(gè)個(gè)體無(wú)角， 379個(gè)個(gè)體有角；
[0057] 2)基因組DNA采用酚-氯仿法提取。
[0058]2、RAD-seq文庫(kù)構(gòu)建
[0059]文庫(kù)構(gòu)建方法參考（RapidSNPDiscoveryandGeneticMappingUsing SequencedRADMarkers)，具體如下：
[0060] 1)用TaqI對(duì)基因組進(jìn)行酶切，連接PI接頭（含有barcode);
[0061] 2)隨機(jī)打斷，連接P2接頭；
[0062] 3)通過(guò)PCR篩選同時(shí)帶有P1和P2接頭的序列；
[0063] 4)選取400bp_700bp的片段進(jìn)行測(cè)序，其中，每個(gè)樣本平均得到1. 2G的數(shù)據(jù)，平均 測(cè)序深度15X。
[0064] 3、關(guān)聯(lián)分析
[0065] 1)采用Plink軟件進(jìn)行GWAS分析，從14萬(wàn)個(gè)SNP中篩選出3個(gè)與山羊角型相關(guān) 的SNP，具體信息如表1。
[0066] 2)對(duì)三個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型與表現(xiàn)型進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析（結(jié)果見(jiàn)表2、表 3)，當(dāng)SNP位點(diǎn)1基因型為T(mén)T，或者SNP位點(diǎn)2基因型為CC，或者SNP位點(diǎn)3基因型為T(mén)T 時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角（概率分別為96. 20%、96· 79%、96· 25% )。當(dāng)SNP位點(diǎn)1和SNP位點(diǎn) 2和SNP位點(diǎn)3的基因型分別為T(mén)T和CC和TT時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角（概率96. 68% )。
[0067] 圖1顯示了上述三個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)的曼哈頓圖。如圖1所示，橫坐標(biāo)為染色體編 號(hào)，縱坐標(biāo)為關(guān)聯(lián)分析-logP值，點(diǎn)線(xiàn)為基因組水平5%顯著的閾值線(xiàn)（6. 6)，單核甘酸多 態(tài)性標(biāo)記的顏色對(duì)應(yīng)特定染色體。
[0068] 表1青山羊角型相關(guān)的SNPs基本信息
[0069]
[0070] 注：a.用RAD-seq得到的SNP側(cè)翼序列進(jìn)行BLAST，將其定位在基因組中（Capra hircusCHIR_1. 0)〇
[0071] b.位點(diǎn)1-3分別有1、1和2個(gè)體基因型缺失。c.關(guān)聯(lián)分析中用x2檢驗(yàn)得到的 P值。
[0072] 由圖1、表1所示的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果及統(tǒng)計(jì)信息表明：該組SNP位點(diǎn)與山羊 角型性狀極顯著相關(guān)（3. 19X10 24、6. 15X10'1.60X10 27)。進(jìn)而，表明SNP位點(diǎn)為判斷 山羊角型相關(guān)的SNP標(biāo)記。
[0073] 表2三種SNP位點(diǎn)不同基因型的統(tǒng)計(jì)信息
[0074]
[0076] 表3不同基因型組合統(tǒng)計(jì)信息
[0077]

[0078] 注：基因型組合TG-CC-TC，TG-CC-TT，TT-TC-TT個(gè)體數(shù)都為0,因此沒(méi)有列入統(tǒng)計(jì)。
[0079] 表2、表3所示的統(tǒng)計(jì)信息表明：位點(diǎn)1基因型TT，位點(diǎn)2基因型CC或者，位點(diǎn)3 基因型TT足以判斷山羊的角型性狀（山羊有角概率分別為96. 20%、96. 79%、96. 25% )， 當(dāng)位點(diǎn)1和位點(diǎn)2和位點(diǎn)3的基因型分別為T(mén)T和CC和TT時(shí)，也足以判斷山羊的角型性狀 (山羊有角概率96.68% )。
[0080] 實(shí)施例2與山羊角型相關(guān)的SNP標(biāo)記的測(cè)序驗(yàn)證
[0081] 2. 1提取待測(cè)青山羊血液樣品中的基因組DNA
[0082] 待測(cè)青山羊血液樣品來(lái)自山東翰龍羊業(yè)股份有限公司青山羊，隨機(jī)選取5份，按 照實(shí)施例1中所述的DNA提取方法抽提基因組DNA。
[0083] 2. 2擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的核苷酸片段
[0084] 以前述提取獲得的各待測(cè)青山羊血液樣品中的基因組DNA為模板，利用正向引物 AGCACATACTCATTCCTGGT(SEQIDN0:4)和反向引物TGTGCACTCAGCTGCATTGT(SEQIDN0:5)， 正向引物GAATGACCTGATGCTTCAAT(SEQIDNO:6)和反向引物CGTACTTGATGCAGTGTTAT(SEQ IDN0:7)，正向引物GCAGGCAAATTCTCTACTGT(SEQIDN0:8)和反向引物 ATCAGCTTTCACATGCACAT(SEQID勵(lì)：9)，擴(kuò)增出待測(cè)5即所在的核苷酸片段。該？0?擴(kuò)增 的擴(kuò)增體系以 20μ1 計(jì)為：25-50ng/μ1 的模板DNA2μ1，lOpmol/μ1 的SEQIDNO:4-9 所示的引物各 〇· 3μ1，lOmmol/L的dNTPmixO. 5μl，5U/y1 的TaqDNA聚合酶(λ2μ1， 10XPCR反應(yīng)緩沖液2μ1，余量為雙蒸水；該P(yáng)CR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C5分鐘；94°C30 秒，56°C30秒，72°C30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C5分鐘。
[0085] 2. 3測(cè)序識(shí)別SNP位點(diǎn)基因型
[0086] 前述步驟中所獲得的PCR產(chǎn)物先經(jīng)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一特異性條 帶后（圖2顯示了三種SNP標(biāo)記位點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖，其中，左側(cè)、中間為電泳結(jié) 果圖，目標(biāo)片段分別為29(^?、30(^?、32(^?，右側(cè)為對(duì)應(yīng)的1&^1?^圖），再于4813730測(cè)序 儀上進(jìn)行單向測(cè)序，識(shí)別SEQIDNO:1-3序列中501bp處（即本發(fā)明的三種SNP標(biāo)記）的 基因型。其中，三個(gè)位點(diǎn)基因型的測(cè)序峰圖如圖3所示。
[0087] 在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不 一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何 的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0088] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一組山羊角型性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，包含： 第一 SNP標(biāo)記，所述第一 SNP標(biāo)記為山羊1號(hào)染色體148054417位置的堿基T或G ; 第二SNP標(biāo)記，所述第二SNP標(biāo)記為山羊1號(hào)染色體148417531位置的堿基T或C ; 第三SNP標(biāo)記，所述第三SNP標(biāo)記為山羊1號(hào)染色體148431198位置的堿基T或C。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組SNP標(biāo)記，其特征在于， 當(dāng)所述第一 SNP標(biāo)記基因型為T(mén)T時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角的概率為96. 20% ; 當(dāng)所述第二SNP標(biāo)記基因型為CC時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角的概率為96. 79% ; 當(dāng)所述第三SNP標(biāo)記基因型為T(mén)T時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角的概率為96. 25% ; 當(dāng)所述第一 SNP標(biāo)記基因型為T(mén)T，所述第二SNP標(biāo)記基因型為CC，且所述第三SNP標(biāo) 記基因型為T(mén)T時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角的概率為96. 68%。3. -組用于檢測(cè)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的一組SNP標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，包 含： 第一引物對(duì)，所述第一引物對(duì)具有SEQ ID NO :4-5所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)所述第 一 SNP標(biāo)記； 第二引物對(duì)，所述第二引物對(duì)具有SEQ ID NO :6-7所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)所述第 二SNP標(biāo)記；以及 第三引物對(duì)，所述第三引物對(duì)具有SEQ ID NO :8-9所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)所述第 三SNP標(biāo)記。4. 一種用于檢測(cè)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一組SNP標(biāo)記的試劑盒，其特征在于，包 含： 權(quán)利要求3所述的一組引物對(duì)。5. 權(quán)利要求1_2任一項(xiàng)所述的一組SNP標(biāo)記、權(quán)利要求3所述的一組引物對(duì)或權(quán)利要 求4所述的試劑盒，在山羊選育中的用途。6. -種檢測(cè)山羊角型性狀的方法，其特征在于，通過(guò)對(duì)待測(cè)山羊進(jìn)行權(quán)利要求1-5任 一項(xiàng)所述的一組SNP標(biāo)記的檢測(cè)，預(yù)測(cè)所述待測(cè)山羊的角型性狀。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，通過(guò)對(duì)待測(cè)山羊進(jìn)行權(quán)利要求1-5任一項(xiàng) 所述的一組SNP標(biāo)記的檢測(cè)，預(yù)測(cè)所述待測(cè)山羊的角型性狀，進(jìn)一步包括 ： 提取待測(cè)山羊的基因組DNA ; 利用權(quán)利要求3所述的一組引物對(duì)，將所述待測(cè)山羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以便 獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以便獲得測(cè)序結(jié)果； 基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述待測(cè)山羊的所述一組SNP標(biāo)記中每一種的基因型；以及 基于所述待測(cè)山羊的所述一組SNP標(biāo)記中每一種的基因型，預(yù)測(cè)所述待測(cè)山羊的角型 性狀。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于， 當(dāng)所述第一 SNP標(biāo)記基因型為T(mén)T時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角的概率為96. 20% ; 當(dāng)所述第二SNP標(biāo)記基因型為CC時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角的概率為96. 79% ; 當(dāng)所述第三SNP標(biāo)記基因型為T(mén)T時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角的概率為96. 25% ; 當(dāng)所述第一 SNP標(biāo)記基因型為T(mén)T，所述第二SNP標(biāo)記基因型為CC，且所述第三SNP標(biāo) 記基因型為T(mén)T時(shí)，山羊表現(xiàn)為有角的概率為96. 68%。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。其中，該組SNP標(biāo)記包含：第一SNP標(biāo)記，所述第一SNP標(biāo)記為山羊1號(hào)染色體148054417位置的堿基T或G；第二SNP標(biāo)記，所述第二SNP標(biāo)記為山羊1號(hào)染色體148417531位置的堿基T或C；第三SNP標(biāo)記，所述第三SNP標(biāo)記為山羊1號(hào)染色體148431198位置的堿基T或C。本發(fā)明的SNP標(biāo)記與山羊的角型性狀緊密相關(guān)，能夠有效用于山羊的分子標(biāo)記輔助育種。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105238778
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410329308
【發(fā)明人】李勇, 全志武, 張耕耘, 張清峰, 宋峰峰, 李玉杰, 黃蘋(píng), 汪仁一, 蔡雁捷
【申請(qǐng)人】深圳華大農(nóng)業(yè)與循環(huán)經(jīng)濟(jì)科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2014年7月11日