一種乳腺癌pik3ca突變基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種乳腺癌中PIK3CA突變基因及其在輔助 制備乳腺癌診斷試劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌，所有女性和家庭的夢魘。全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)（GL0B0CAN)顯示每 年約有130萬婦女患乳腺癌，45. 8萬人死于乳腺癌，無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，乳 腺癌都是全世界婦女目前面臨的最為常見的惡性腫瘤，也是引起女性死亡的重要病因。自 90年代以來，中國的乳腺癌發(fā)病率增長速度是全球的2倍多，每年中國乳腺癌新發(fā)數(shù)量和 死亡數(shù)量分別占全世界的12. 2%和9. 6%1。目前，乳腺癌是中國女性發(fā)病率最高的癌癥，癌 癥死亡原因位居第六，且年輕化趨勢顯著，預計到2021年，中國乳腺癌患者將高達250萬 (Fan，L.etal. 2014)。雖然早期檢查及診斷技術的提高，手術及綜合輔助治療的進步， 使得患者的預后有較明顯改善，但是總生存率并不理想（IndependentUKPanelonBreast CancerScreening. 2012)。對于特定的分子亞型，由于對藥物的原發(fā)或繼發(fā)耐藥、甚至 缺乏特定的治療祀點，使得部分中晚期病人缺乏有效的治療手段（Garcia-Closas,M.et al. 2014)。因此，尋找發(fā)生有效的腫瘤標志物對于提高乳腺癌的診斷和預測發(fā)生、發(fā)展及 改善預后具有重要的臨床指導意義。
[0003] 腫瘤標志物可以有效地作為臨床診斷依據(jù)，可以監(jiān)聽高位人群、早期診斷、指導治 療、判斷治療療效、檢測復發(fā)及轉移，是腫瘤患者的重要檢查指標。乳腺癌是一種全身性疾 病、其發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多因素、多環(huán)節(jié)的復雜過程，包括癌基因的激活以及抑癌基因 的失活等。因此，基因突變在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。PIK3CA基因 是近年來被發(fā)現(xiàn)除P53突變和Her-2擴增之外最常見和最重要的乳腺癌中的突變基因，突 變比率高達40%，其突變可導致多條信號通路在不同水平發(fā)生調控異常，從而促進腫瘤細胞 的增殖和存活（Bachman,Κ·E.etal· 2004)。
[0004] 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K)是一種可使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇 激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶雙重活性（Fruman，D.A.etal. 2014)，調節(jié)細胞增殖、存活、迀移、凋亡和細胞周期等多種生物學功能。PIK3CA基因編碼 IA類PI3K催化亞單位ΡΙΙΟα，其定位于3q26. 3,包含21個外顯子（Volinia，S.etal. 1994)。KANGS等研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因在多種腫瘤中扮演著癌基因的角色，約30%的人類 實體瘤存在PIK3CA基因的突變，其中80%-90%的突變發(fā)生在該基因的第9和第20外顯子， 分別對應該酶的螺旋區(qū)和激酶區(qū)。該區(qū)域的改變引起PIK3CA過表達、P110α活性增加，進 而激活下游ΑΚΤ等信號分子，導致成纖維細胞和乳腺上皮細胞的生長和轉化，并抑制細胞 凋亡，最終導致腫瘤發(fā)生（Vivanco，I.etal. 2002)?，F(xiàn)有研究顯示，應用PCR或基因測 序的方法檢測組織中PIK3CA基因的突變情況，可提高腫瘤診斷的敏感性；PIK3CA基因突變 的腫瘤細胞對PI3K抑制劑更敏感，特異性地針對PIK3CA突變的靶向治療可有效降低惡性 腫瘤的發(fā)病率和死亡率。盡管PIK3CA突變對乳腺癌的診治及預后的影響還需進一步研究， 但從目前已有的研究數(shù)據(jù)可以看出PIK3CA高頻突變和突變熱點區(qū)域的發(fā)現(xiàn)對于乳腺癌基 因診斷以及靶向治療的選擇具有重要的臨床意義。
[0005]S553fs*7突變是PIK3CA基因突變之一，然而關于PIK3CA基因S553fs*7突變在乳 腺癌中尚未被報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種乳腺癌中PIK3CA突變基因，該突變基因具有 c. 1658_1659GT>C突變位點，其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示，乳腺癌PIK3CA突變基因 編碼的突變蛋白S553fs*7氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0007] 該突變蛋白具有圖5所示的三維空間結構。
[0008] 本發(fā)明另一目的是將上述乳腺癌中PIK3CA突變基因作為一種分子標記，即作為 檢測乳腺癌的分子標記物。
[0009] 本發(fā)明還可將將乳腺癌PIK3CA突變基因應用在制備乳腺癌臨床診斷產品中； 進一步地，在于提供一套檢測PIK3CA基因突變的引物組合，一對特異擴增PIK3CA基因 9號外顯子的正向引物和反向引物，其正向引物的核苷酸序列如SEQIDN0 :3所示，反向引 物的核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示。
[0010] 本發(fā)明將乳腺癌PIK3CA突變基因應用在制備用于乳腺癌臨床診斷的檢測試劑盒 中，所述試劑盒包括核苷酸序列如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示的引物。
[0011] 所述試劑盒組分包含下列組分中的一種或幾種：聚合酶、PCR反應緩沖液、正反向 引物，純水。
[0012] 上述PCR反應總體系為25yL:其中，PfuMix混合液12.5yL，所述正向引物 (5μM)的體積1μL，反向引物（5μM)的體積1μL，所述DNA模板1μL，其余為純水。PCR 反應條件為：①94°C，5min預變性；②94°C，30s變性；③55°C，30s退火；④72°C，35s延伸； 循環(huán)②至④35次；⑤72°C，5min。
[0013] 通過對乳腺癌組織、癌旁組織及正常人血液樣本中PIK3CA基因突變檢測，本發(fā)明 首次發(fā)現(xiàn)了乳腺癌中PIK3CA基因S553fs*7突變，其對于臨床乳腺癌早期篩查、指導臨床用 藥以及監(jiān)測腫瘤預后具有很好的實際應用價值。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明PIK3CA基因9號外顯子突變分布情況示意圖； 圖2是本發(fā)明不同樣本中PIK3CA基因第9外顯子S553fs*7突變測序圖； 圖3是本發(fā)明不同樣本中PIK3CA基因第9外顯子S553fs*7突變比率； 圖4是本發(fā)明PIK3CA基因結構域示意圖； 圖5是本發(fā)明PIK3CA基因S553fs*7突變前后空間構象對比圖。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，該領域的技術人員可以根據(jù)上述本
【發(fā)明內容】
對本發(fā)明做 出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特異表明，所用試劑均為分析純，所有試 劑均可從商業(yè)渠道獲得，百分比均為質量百分比。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按 照《分子克隆實驗指南》中所述常規(guī)條件，或試劑制造廠商所建議的條件實施。除非另行定 義，文中所使用的所有專業(yè)和科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。
[0016] 實施例1:乳腺癌及癌旁組織中DNA提取 1、 實驗材料 TES緩沖液(將一個50mL離心管洗干凈，高溫高壓滅菌后，加入0. 5mL1M的Tris-HCLlmL0. 5M的EDTA和2. 5mL的10%SDS，加超純水補足到50mL，調PH=8. 0后室溫 保存)，20mg/mL蛋白酶K，3M醋酸鈉（pH=5. 2)，TEBuffer，苯酸，氯仿，異戊醇，無水乙醇，TE 溶液。
[0017] 2、實驗方法 2. 1組織塊解凍，剪取約0. 5g組織，放入1. 5mL離心管中，剪碎； 2. 2加入0· 45mL