TES緩沖液混勻，再加入50μLSDS(10%)，5. 0μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻后，于56°C消化4-6h，每2h搖1次，至溶液清澈； 2. 3放置到室溫，加入等體積飽和酚（500yL)，顛倒混勻，12000rpm，離心10min，分離 水相和有機(jī)相，小心吸取上層含核酸的水相，到一個(gè)新的1. 5mL離心管； 2. 4加入等體積酚：氯仿：異戊醇=25 :24 :1的混合液，顛倒混勻，12000rpm，離心10min，取上層轉(zhuǎn)移到新的1. 5mL離心管中； 2. 5加入等體積氯仿：異戊醇=24 :1的溶液，顛倒混勻，12000rpm，離心10min，取上層 清液到一個(gè)新的1. 5mL離心管； 2. 6加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，上下顛倒混 勻后放置于-20°(：冰箱111，12000印111，4°(：，離心10 1^11，棄乙醇； 2.7加入75%的乙醇洗滌，8000rpm，離心5min; 2. 8小心的倒掉上清，在吸水紙上扣干殘液，打開管蓋，室溫靜置lOmin，待乙醇揮發(fā)干 凈，根據(jù)DNA的沉淀量加入適量的TE溶解DNA; 4 °C過夜溶解，測定濃度后，于_20°C保存待 用。
[0018] 實(shí)施例2:血液樣本中DNA提取 1、 實(shí)驗(yàn)材料 白細(xì)胞裂解液，紅細(xì)胞裂解液，蛋白酶K(10mg/mL)，苯酚，氯仿，異戊醇，無水乙醇，TE溶液。
[0019] 2、實(shí)驗(yàn)方法 2. 1將4mL新鮮血液移至15mL離心管中，加入紅細(xì)胞裂解液，上下顛倒混勻，4000g， 4°C離心，15min; 2. 2去上清，反復(fù)洗血2_3次； 2. 3去上清，加入lmL白細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，均分至兩個(gè)1. 5mL的離心管中，一管 于-80 °C凍存待用； 2. 4另一管加入20μL蛋白酶K( 10mg/mL)，溫和地翻轉(zhuǎn)8次混勻，56°C溫育過夜(直至 沒有肉眼可見的懸浮物)，不時(shí)翻轉(zhuǎn)混勻； 2. 5加入等體積飽和酚（500μL)，顛倒混勻，12000rpm，離心10min，分離水相和有機(jī) 相，小心吸取上層含核酸的水相，到一個(gè)新的1. 5mL離心管； 2. 6加入等體積酸：氯仿：異戊醇=25 :24 :1的溶液，顛倒混勾，12000rpm，離心10min，取上層轉(zhuǎn)移到新的1. 5mL離心管中； 2. 7加入等體積氯仿：異戊醇=24 :1的溶液，顛倒混勻，12000rpm，離心10min，取上層 清液到一個(gè)新的1. 5mL離心管； 2. 8加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，上下顛倒混 勻后放置于-20°C冰箱lh。12000rpm，4°C，離心10min，棄乙醇； 2. 9加入75%的乙醇洗滌，8000rpm，離心5min; 3. 0小心的倒掉上清，在吸水紙上扣干殘液，打開管蓋，室溫靜置lOmin，待乙醇揮發(fā)干 凈，根據(jù)DNA的沉淀量加入適量的TE溶解DNA，4 °C過夜溶解，測定濃度后，于_20°C保存待 用。
[0020] 實(shí)施例3: PCR擴(kuò)增PIK3CA基因9號(hào)外顯子并測序 1、 實(shí)驗(yàn)材料 2XPfuMix，實(shí)施例1、2中所提取的DNA模板，去離子水，擴(kuò)增PIK3CA基因9號(hào)外顯子 的正反向引物(詳見表1)，PCR儀，1%的瓊脂糖凝膠，電泳儀。
[0021] 表 1
2、 實(shí)驗(yàn)方法 2. 1挑選實(shí)施例1、2中質(zhì)量較好的DNA樣本，包括88例乳腺癌組織DNA，19例乳腺癌 癌旁組織DNA，22例正常人血液樣本DNA; 2. 2配置如下表PCR反應(yīng)體系： 表2
[0022] 2.3反應(yīng)條件：①94°C，5min預(yù)變性；②94°C，30s變性；③55°C，30s退火； ④72°C，35s延伸；循環(huán)②至④35次；⑤72°C，5min; 2. 4PCR反應(yīng)結(jié)束后，鋪1%的膠檢測，并送至生工生物工程(上海）股份有限公司進(jìn)行 測序； 3、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 測序結(jié)果顯示，在88例乳腺癌組織標(biāo)本中共檢測到41例PIK3CA基因9號(hào)外顯子的突 變，突變比率高達(dá)46. 6%，其中E545A/K突變率為43. 2%，S553fs*7突變率為44. 3% (表3、 4、5、6、7)。而在19例乳腺癌癌旁組織和22例正常人血液樣本中均未檢測到PIK3CA基因 9號(hào)外顯子的突變(見圖1、圖2、圖3)。E545A/K為文獻(xiàn)中已報(bào)道的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，值得注 意的是S553fs*7的突變?cè)赥CGA數(shù)據(jù)庫中尚未報(bào)道。進(jìn)一步的分析檢索，僅有少量文獻(xiàn) 報(bào)道S553fs*7的突變?cè)诟伟?、子宮內(nèi)膜癌以及B細(xì)胞淋巴癌中發(fā)生。而在本研究中 S553fs*7雙位突變比率在所收集的乳腺癌中高達(dá)44. 3%，S553fs*7突變位于PIK3CA基因 的螺旋區(qū)，其突變可以導(dǎo)致PIK3CA基因提前終止翻譯，同時(shí)影響其螺旋區(qū)和激酶區(qū)的功 能（圖4)。
[0023] 利用Swissmodel數(shù)據(jù)庫（http://swissmodel.expasy.org/repository/)我們 對(duì)PIK3CA基因發(fā)生S553fs*7突變后其結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行了初步分析（圖5)。結(jié)果顯示，突 變后其空間構(gòu)象發(fā)生了明顯改變，可能會(huì)因此對(duì)其下游激酶PI3Ks活性的調(diào)節(jié)機(jī)制以及 相關(guān)的信號(hào)通路改變?cè)斐捎绊?。提示PIK3CA基因S553fs*7突變與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切 相關(guān)。
[0024] 表 3
[0025] 表 4
[0027]表 6
[0029] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種乳腺癌PIK3CA突變基因，其特征在于：該突變基因具有c. 1658_1659GT>C突變 位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。2. 權(quán)利要求1乳腺癌PIK3CA突變基因編碼的突變蛋白S553fs*7,其特征在于：氨基酸 序列如SEQ ID NO :2所示。3. -種分子標(biāo)記，其為權(quán)利要求1所述的乳腺癌PIK3CA突變基因。4. 權(quán)利要求1所述的乳腺癌PIK3CA突變基因在制備乳腺癌臨床診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的乳腺癌PIK3CA突變基因在制備用于乳腺癌臨床診斷的檢測試劑 盒中的應(yīng)用，所述試劑盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的引物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳腺癌PIK3CA突變基因及其應(yīng)用，該突變基因具有c.1658_1659GT>C突變位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；本發(fā)明通過直接測序法，對(duì)88例乳腺癌組織、19例乳腺癌癌旁組織以及22例正常人血液樣本中PIK3CA基因突變進(jìn)行檢測，首次發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因S553fs*7突變?cè)谌橄侔┙M織中高達(dá)44.3%，而在乳腺癌癌旁組織和正常人血液樣本中均無突變發(fā)生；提示此突變可用于輔助乳腺癌的早期診斷；因此，本發(fā)明對(duì)于臨床上防治乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N9/12, C12N15/54
【公開號(hào)】CN105238799
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510675152
【發(fā)明人】盛苗苗, 羅瑛, 周小龍, 唐文如, 王芳, 趙月光, 李珊珊
【申請(qǐng)人】昆明理工大學(xué)
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年10月19日