一種豬偽狂犬病病毒、疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利說明】-種豬偽狂犬病病毒、疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)為專利申請(qǐng)2014102412792的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2014年5月28 日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為一種豬偽狂犬病病毒、疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及一種疫苗組合物，屬于動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003] 偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由瘤疹病毒科化erpesviridae)α亞科中的豬 瘤疹病毒I型（Suidhe巧esvirus1strain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生 動(dòng)物的一種W發(fā)熱、奇癢（除豬外）及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國 廣泛存在，危害嚴(yán)重，是制約規(guī)模化豬場(chǎng)生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產(chǎn)、死 胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻搏，死亡率高。PRV具有較強(qiáng)的泛嗜性、神經(jīng)嗜性及潛 伏感染特性，在外周神經(jīng)系統(tǒng)可W長期潛伏感染，當(dāng)潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒， 被潛伏感染的宿主就會(huì)發(fā)病。
[0004] 研究表明亞單位疫苗能夠給免疫動(dòng)物提供相應(yīng)的保護(hù)，亞單位疫苗是利用基因工 程方法將病原保護(hù)性抗原基因克隆到原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中，使其高效表達(dá)而制成的疫 苗。目前發(fā)現(xiàn)偽狂犬病毒糖蛋白中的濁、gC、曲均能使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，運(yùn)些抗體無論是 在體內(nèi)、體外，還是在有無補(bǔ)體存在的情況下都有中和PRV的能力。"偽狂犬病亞單位疫苗 研究進(jìn)展"（楊承槐，類高明，湛南輝《江西畜牧獸醫(yī)雜志》2004年第3期）公開了在偽狂犬 病病毒目前已發(fā)現(xiàn)的11種糖蛋白中，濁、gC、曲均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。在沒有補(bǔ)體 的參與下，濁、gC、曲的單克隆抗體能中和PRV。豬和小鼠注射抗?jié)?、gC、曲的單克隆抗體 均能抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊。因此，濁、gC、曲是研制PRV亞單位疫苗的首選蛋白。糖蛋白曲 是一種重要的中和抗原，也是保護(hù)性抗體的主要目標(biāo)，能誘導(dǎo)較好的保護(hù)反應(yīng)。US6858385 和US6521231公開了利用豬偽狂犬病病毒曲蛋白可W制備疫苗用于豬偽狂犬病的預(yù)防。
[0005] 豬PRV只有一個(gè)血清型，通常認(rèn)為毒株的交叉保護(hù)力很強(qiáng)，但目前仍存在仔豬注 射商品化疫苗后發(fā)生典型豬偽狂犬病，例如長時(shí)間體溫升高，精神沉郁，食欲減退，出現(xiàn)呼 吸道和/或神經(jīng)癥狀。突出表現(xiàn)為任何年齡的豬都會(huì)感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短 (1~2天），發(fā)病率在10%~100%之間，發(fā)病豬死亡率在10%~100%之間（仔豬死亡率 可高達(dá)100% )，感染后可引起豬只高熱（40~42°C，持續(xù)3日W上），呼吸困難，腹瀉，喘， 咳嗽，打噴曖，后肢麻搏，犬坐，突然倒地，抽搖，側(cè)邸不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而 死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕母豬流產(chǎn)（高達(dá)35% )，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14 日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀?，F(xiàn)有技術(shù)的疫苗免疫豬只后不能完全抵抗野毒攻擊， 依然會(huì)出現(xiàn)高熱，精神沉郁，食欲下降或廢絕等癥狀，感染率超過80 %，發(fā)病率超過30 %， 死亡率在10%~20%之間。現(xiàn)有技術(shù)還沒有疫苗能夠解決針對(duì)豬偽狂犬變異株引起的偽 狂犬病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種豬偽狂犬病病毒株，該豬偽狂犬病 病毒株可用于制備疫苗，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明該疫苗對(duì)于豬偽狂犬病具有良好的免疫作用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種核巧酸序列，所述核巧酸序列實(shí)質(zhì)上編碼序列表SEQIDNO. 1 所示的蛋白。
[0008] 本發(fā)明提供了一種核巧酸序列，所述核巧酸序列實(shí)質(zhì)上編碼序列表SEQIDNO. 2 所示的蛋白。
[0009] 本發(fā)明提供了一種核巧酸序列，所述核巧酸序列實(shí)質(zhì)上編碼序列表SEQIDNO. 3 所示的蛋白。
[0010] "編碼序列"在本申請(qǐng)中是指一種DNA序列，其能夠被轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的RNA序列。
[0011] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的是提供一種豬偽狂犬病病毒株，其中， 所述豬偽狂犬病病毒株具有序列表SEQIDNO. 4所示的核巧酸序列編碼的曲糖蛋白。
[0012] 本發(fā)明術(shù)語"曲糖蛋白"，是豬偽狂犬病病毒進(jìn)行感染必需的結(jié)構(gòu)蛋白，是成熟的 病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也稱為甜50蛋白。
[0013] 本發(fā)明術(shù)語"同源性"在本申請(qǐng)中是指兩條氨基酸序列或兩條核巧酸序列的相 似程度。氨基酸序列或核巧酸序列的同源性可W通過本領(lǐng)域公知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ?jì) 算得到，例如，可W將目標(biāo)氨基酸（或核巧酸）序列與參比氨基酸（或核巧酸）序列進(jìn)行 序列比對(duì)，必要時(shí)可W引入空缺，使得兩條比對(duì)的序列間相同的氨基酸（或核巧酸）數(shù)目 達(dá)到最優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上計(jì)算兩條氨基酸（或核巧酸）序列之間相同氨基酸（或核巧 酸）的百分比。氨基酸（或核巧酸）序列的比對(duì)和同源性的計(jì)算可W通過本領(lǐng)域公知的 軟件實(shí)現(xiàn)，例如，但不限于，BLAST軟件（在美國國立生物技術(shù)信息中屯、（NCBI)的網(wǎng)址上 可獲得：ht1:p://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者見，例如，AltschulS.F.et al,J.Mol.Biol. , 215 :403-410 (1990)；StephenF.etal,NucleicAcidsRes. ,25： 3389-3402(1997))，ClustalW2軟件（在歐洲生物信息研究所網(wǎng)址上可獲得：http://麗w. eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另見，例女日，HigginsD.G.etal,MethodsinEnzymology, 266:383-402(1996);LarkinM.A.etal，Bioinformatics(Oxford,England) ,23(21): 2947-8(2007));和TCoffee軟件等（在瑞典生物信息學(xué)研究所的網(wǎng)站上可W獲得： http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另見，例女曰，Poirot0.etal,NucleicAcidsRes. ,31(13) :3503-6(2003)；NotredameC.etal,J.Mol. Boil.，302 (1) :205-17 (2000))。使用軟件進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，可W使用軟件提供的默認(rèn)參數(shù)， 或者也可W根據(jù)實(shí)際情況對(duì)軟件提供的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，運(yùn)些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范 圍內(nèi)。
[0014] 優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒株具有序列表SEQIDNO. 5所示的核巧酸序列編碼 的濁糖蛋白。
[0015] 優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬病病毒，它具有SEQIDNO. 2的氨基酸序列的濁糖蛋白。
[0016] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所述豬偽狂犬病病毒，它具有SEQIDNO. 3的氨基酸序列的 gC糖蛋白。
[0017] 優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病毒株為HN1201株（Pseudor油iesvirus,strainHN1201) 或其培養(yǎng)物，保藏號(hào)為CCTCCNO.V201311;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、；保藏地址為 中國武漢市?武漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日。
[0018] 所述術(shù)語"培養(yǎng)物"是病毒的不同代次傳代培養(yǎng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉不同代次 之間其基因序列僅可能會(huì)發(fā)生微小的變異，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)物是5-35代W內(nèi)的培養(yǎng)物。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種豬偽狂犬病病毒疫苗組合物，其中，所述疫苗組 合物包括免疫量的豬偽狂犬病病毒株的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、合成疫苗或基 因工程疫苗。
[0020] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括免疫量的所述豬偽狂犬病病毒株HN1201株或其培 養(yǎng)物的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、合成膚疫苗或基因工程疫苗。
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物包含所述豬偽狂犬病病毒或其抗原作為活性成分。 用于疫苗的組合物的豬偽狂犬病病毒具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列或與其共有98% W上 同源性的氨基酸序列表示的曲糖蛋白。
[0022] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物的豬偽狂犬病病毒為HN1201株或其培養(yǎng)物。
[0023] 用于本發(fā)明的抗原是指病毒組分的抗原部分，它引起免疫應(yīng)答，并可包含具有與 SEQ ID NO. 1的氨基酸序列。
[0024] 可選擇地，抗原可包含具有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列或其片段共有95% W上核 巧酸同源性的濁蛋白。<