br>[00巧]可選擇地，抗原可包含具有SEQ ID NO. 3的氨基酸序列或其片段共有95% W上核 巧酸同源性的gC蛋白。
[0026] 本發(fā)明所用的術(shù)語"活疫苗"指的是W毒力已經(jīng)減弱但仍可在宿主體內(nèi)或細胞上 復(fù)制的病毒制備的疫苗。本發(fā)明所用的術(shù)語"減毒"用于指W使病原喪失致病性、但保持免 疫原性的方式對基因進行突變來人工降低病原體毒性。通常，通過UV福射、化學(xué)處理或體 外連續(xù)高階繼代培養(yǎng)實現(xiàn)減毒。人工的基因改變，例如將已知序列中的特定核巧酸缺失W 使毒力減弱。
[0027] 所用的術(shù)語"滅活疫苗"，也稱作失活疫苗，指的是用作抗原W產(chǎn)生免疫力的滅活 病毒的混懸液。滅活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可W很容易 地產(chǎn)生滅活疫苗。例如，通過用甲醒溶液處理病毒可獲得全病毒滅活疫苗。裂解型疫苗可 在用酸處理后由病毒包膜制備得到。
[002引術(shù)語"亞單位疫苗"指的是利用基因工程方法將病原體的保護性抗原基因克隆到 原核或真核表達系統(tǒng)中，使其高效表達而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反應(yīng)的可能 性小。例如，表達的豬偽狂犬病病毒的曲或gC蛋白可用于制備亞單位疫苗。
[0029] 術(shù)語"合成膚疫苗"指的是一種僅含免疫決定簇組分的小膚，即用人工方法按天 然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護性短膚，與載體連接后加佐劑所制成的疫苗。
[0030] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括>l〇6'°TCIDw/ml的豬偽狂犬病病毒株HN1201株或 其培養(yǎng)物滅活疫苗。
[0031] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物可包含每頭份l〇6'°TCI^。量的豬偽狂犬病病毒。當(dāng) 豬偽狂犬病病毒W(wǎng)少于ι〇6·°τα^。的量使用時，疫苗不能有效刺激抗體產(chǎn)生。另一方面，超 過的量可能是不經(jīng)濟的。
[0032] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括豬偽狂犬病病毒株ΗΝ1201株或其培養(yǎng)物的25~ 100μg/劑量曲蛋白抗原。
[0033] 此外，本發(fā)明的豬偽狂犬疫苗可與其他失活病原體或抗原組合使用W制備抵抗包 括豬偽狂犬病的各種疾病的聯(lián)合疫苗或復(fù)合疫苗。本發(fā)明所用的術(shù)語"聯(lián)合疫苗"用于指 從本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒與至少一種不同病毒的病毒混合物制備的疫苗。術(shù)語"復(fù)合疫 苗"指的是從病毒和細菌制備的疫苗。例如，本發(fā)明的豬偽狂犬病毒可與豬攝病毒、豬繁殖 與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒和/或副豬嗜血桿菌、支原體混合或組合。
[0034] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物進一步包括介質(zhì)、佐劑、賦形劑。
[0035] 本發(fā)明的疫苗組合物還可包含介質(zhì)、佐劑和/或賦形劑。生理鹽水或蒸饋水可用 作介質(zhì)。用于疫苗組合物的佐劑的例子包括弗氏的不完全佐劑或完全佐劑、氨氧化侶凝膠、 植物油或礦物油等。賦形劑的例子包括憐酸侶、氨氧化侶和硫酸侶鐘，但不限于此。在實踐 中，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于疫苗制備的所有物質(zhì)均可適用于本發(fā)明的疫苗組合物。
[0036] 本發(fā)明的再一目的是提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括增 殖培養(yǎng)所述豬偽狂犬病病毒株HN1201株，滅活，加入佐劑，攬拌均勻。
[0037]具體地，所述方法為：（1)將豬偽狂犬病病毒疫苗株接種于各自的易感細胞，并培 養(yǎng)所述接種后的易感細胞；收獲細胞培養(yǎng)物；
[00測 似用甲醒溶液、B化（β-丙內(nèi)醋）或邸1(二乙締亞胺）處理來自步驟（1)的病 毒；
[0039] 所述易感細胞可W是傳代細胞系，也可W是原代細胞。適合于豬偽狂犬病病毒 的易感細胞包括但不限于，ST細胞系（ATCC編號：C化-1746)、ΡΚ-15細胞系（ATCC編號： C化-33)、非洲綠猴腎細胞Marc-145細胞系（ATCC編號：C化-12219)、牛腎細胞MD服細胞系 (ATCC編號：αΧ-22)、牛睪丸傳代細胞BT細胞系（ATCC編號：C化-1390)、Vero細胞系（ATCC 編號：C化-81)、BHK-21細胞系（ATCC編號：C化-10)、豬腎傳代細胞系（如JBRS-2,見例 女曰，DECASTR0,M.P.1964.Behavioroffootandmouthdiseasevirusincellculture: susceptibilityoftheIB-民S-2swinecellline.ArquivosInstituteBiologicaSl： 63-78)、兔腎傳代細胞系（RK，如：ATCC編號：C化-106)等傳代細胞系，或者雞胚成纖維細胞 和豬腎細胞等原代細胞。原代細胞可W通過本領(lǐng)域公知的方法，用動物體內(nèi)的組織進行分 離和制備。
[0040] 可將根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物制備成口服劑型或非口服劑型。優(yōu)選的是可通過皮 內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或硬腦膜外途徑給予的非口服劑型。
[0041] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括：（1) 克隆所述豬偽狂犬病病毒曲蛋白重組基因；（2)表達所述豬偽狂犬病病毒曲重組蛋白； (3)將所述豬偽狂犬病病毒曲蛋白抗原與佐劑按比例混合，乳化。
[0042] 本發(fā)明的還一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬偽狂犬病病 毒相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0043] 本文所用的術(shù)語"豬偽狂犬病病毒相關(guān)疾病"用于指由豬偽狂犬病毒感染引起的 疾病。它的例子包括發(fā)病仔豬表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、拉稀、體溫升高，一 旦發(fā)病，懷孕母豬可發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒或死胎或繁殖障礙，但不限于此。
[0044] 本文所用的術(shù)語"豬偽狂犬病病毒相關(guān)疾病"可W進一步用于指表現(xiàn)為任何年齡 的豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1~2天），發(fā)病率在10 %~100 %之間，發(fā)病 豬死亡率在10%~100%之間（仔豬死亡率可高達100%)，感染后可引起豬只高熱（40~ 42°C，持續(xù)3日W上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴曖，后肢麻搏，犬坐，突然倒地，抽搖， 側(cè)邸不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕母豬流 產(chǎn)（高達35%)，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀，但不限于 此。上述癥狀與現(xiàn)有技術(shù)中感染了普通豬偽狂犬病病毒后產(chǎn)生的癥狀差異在于：感染了后 會造成感染后成年豬（體重在50kgW上豬）可引起豬只高熱（40~42°C，持續(xù)3日W上）， 呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴曖，后肢麻搏，犬坐，突然倒地，抽搖，側(cè)邸不起，角弓反張，泳 狀劃水，最后衰竭而死；新生及4周齡W內(nèi)的仔豬突然發(fā)病，發(fā)生大批死亡，死亡率達90% W上；發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為體溫上升達4rCW上，食欲廢絕，伴有明顯的神經(jīng)癥狀和腹瀉； 斷奶前后仔豬主要為呼吸系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、流鼻涕等。
[0045] 本文所用的術(shù)語"預(yù)防"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬偽狂犬感染 或推遲疾病發(fā)作的所有行為。術(shù)語"治療"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬偽狂 犬病病毒感染引起的癥狀減輕或轉(zhuǎn)好的所有行為。
【附圖說明】
[0046] 圖1為HN1201株gC氨基酸序列與SA215株gC氨基酸序列同源分析結(jié)果；
[0047] 圖2為HN1201株曲氨基酸序列與SA215株曲氨基酸序列同源分析結(jié)果。
[0048]序列表中：
[0049]莊遜丄邊豬偽狂犬病病毒HN1201株曲氨基酸序列；
[0050]序列2為豬偽狂犬病病毒HN1201株濁氨基酸序列；
[0051]莊遜立邊豬偽狂犬病病毒HN1201株gC氨基酸序列；
[0052]序列4為豬偽狂犬病病毒HN1201株曲核巧酸序列；
[0053]莊遜互邊豬偽狂犬病病毒HN1201株濁核巧酸序列；
[0054]序列6為豬偽狂犬病病毒HN1201株gC核巧酸序列。
【具體實施方式】
[0055] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但運些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但運些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0056] 本發(fā)明中的術(shù)語"頭份"是指每頭豬注射的疫苗量。
[0057]本發(fā)明中所述的"TCID日。"(50% tissue州hure infective dose)是指半數(shù)細胞 培養(yǎng)物感染量，是表示病毒感染力的一種表示方式。
[0058]MEM液體培養(yǎng)基（液）用購自美國LifeTechnologies公司的MEM干粉培養(yǎng)基