混合型己酸菌培養(yǎng)液的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用濃香型白酒窖泥己酸菌來(lái)制作混合型己酸菌培養(yǎng)液的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]己酸菌(Clostridium kluyveri)又稱(chēng)梭狀芽孢桿菌，屬于兼性厭氧微生物，其形狀典型的為梭狀，另外還有短桿型、長(zhǎng)桿型等。己酸菌是濃香型白酒生產(chǎn)中非常重要的產(chǎn)酸微生物，茅臺(tái)試點(diǎn)發(fā)現(xiàn)己酸菌后，濃香型白酒的生產(chǎn)有了飛躍式的發(fā)展。濃香型白酒生產(chǎn)品質(zhì)也有了較大的提高，這充分說(shuō)明了己酸菌在濃香型白酒生產(chǎn)中占有非常重要的作用。古貝春白酒擁有百年的生產(chǎn)歷史，老窖池中存在優(yōu)良的己酸菌，為己酸菌的分離和應(yīng)用提供了優(yōu)越的條件。
[0003]己酸菌的篩選工作如下:
取優(yōu)質(zhì)窖泥l(xiāng)g，搖床粉碎，梯度稀釋?zhuān)?0°c熱水浴處理10分鐘，加入到巴氏培養(yǎng)基中混勻，倒平板，厭氧條件培養(yǎng)。巴氏培養(yǎng)基(固體)配方:乙酸鈉0.5%.硫酸銨0.05%，硫酸鎂
0.02%,磷酸氫二鉀0.04%，酵母膏0.1 %，瓊脂粉2%，乙醇2% (121度滅菌后，倒平板前加入)，碳酸鈣1% (稍后加)，水100%。厭氧環(huán)境培養(yǎng)，培養(yǎng)7?10天，菌落長(zhǎng)出來(lái)了，用無(wú)菌刀切取菌落，反復(fù)純化，也可鏡檢觀察，己酸菌為梭狀芽孢桿菌。經(jīng)過(guò)幾次純化后便得到純種菌株。
[0004]己酸菌株情況驗(yàn)證，采用液體巴氏培養(yǎng)基(配方同上)將分離提純的菌株分別培養(yǎng)7?10天，以備驗(yàn)證。
[0005]己酸菌的定性分析:取4ml混合均勻的巴氏培養(yǎng)基菌液，加入2%的乙酸銅溶液lml，然后加入乙醚1ml，震蕩，靜置，觀察乙醚層的顏色，黃綠色越深說(shuō)明產(chǎn)己酸越多，表明篩選計(jì)算菌株越優(yōu)良。反復(fù)幾次驗(yàn)證，觀察己酸菌株是否有衰退情況。
[0006]經(jīng)過(guò)多次篩選得到優(yōu)良己酸菌株命名為CK-jl，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)菌種比對(duì)，屬于己酸菌。
[0007]現(xiàn)有己酸菌培養(yǎng)液的生產(chǎn)，成本高，人工多，操作復(fù)雜，不適合生產(chǎn)廠(chǎng)家應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種混合型己酸菌培養(yǎng)液的生產(chǎn)方法，解決生產(chǎn)成本高、操作繁瑣復(fù)雜等問(wèn)題。
[0009]本發(fā)明的目的是還提供了混合型己酸菌培養(yǎng)液應(yīng)用方法和再生產(chǎn)方法。
[0010]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是混合型己酸菌培養(yǎng)液的生產(chǎn)方法，包括如下步驟:
(1)培養(yǎng)基配方如下:1000mL水，乙酸鈉8?10g，硫酸鎂0.3?0.4g，硫酸銨0.8?lg，酉孝母膏1.5?2.5g，磷酸氫二鉀0.6?0.8g，1.5?2.5g碳酸I丐(單獨(dú)滅菌)，20?25mL乙醇(不滅菌單獨(dú)加入)；
(2)121°C度下，培養(yǎng)基滅菌20分鐘;
(3)將己酸菌(CK-jl)接種于培養(yǎng)基中，接種容器為若干250mL三角瓶，碳酸鈣、乙醇加入培養(yǎng)基，每個(gè)250mL三角瓶需加入15?20mL的己酸菌菌種，接種后需將沒(méi)有接種的培養(yǎng)基加入到已經(jīng)接種的三角瓶中，以液面在三角瓶口頸部離三角瓶頂端瓶口 4?5cm為宜，接種后采用液體石蠟液封培養(yǎng)，石蠟的使用量為1?1.5mL，接種三瓶，每瓶300?330mL，在33?35°C條件下活化培養(yǎng)5?7天，制得己酸菌種子液，己酸菌濃度為1.5?5.0 X 108CFU/mL，可以作為一級(jí)種子液使用；
(4)按體積5%?8%的比例提取一級(jí)種子液，接種于二級(jí)己酸菌菌種培養(yǎng)基中，接種容器為若干5L三角瓶，二級(jí)己酸菌菌種培養(yǎng)基配方同上述培養(yǎng)基的配方，碳酸鈣、乙醇加入培養(yǎng)基，每個(gè)5L三角瓶需加入300?400mL的一級(jí)種子液，接種后需將沒(méi)有接種的培養(yǎng)基加入到已經(jīng)接種的三角瓶中，以液面在三角瓶口頸部離三角瓶頂端瓶口 4?7cm為宜，接種后采用液體石蠟液封培養(yǎng)，石蠟的使用量為2?3mL，將接種后的二級(jí)己酸菌菌種培養(yǎng)基在33?35°C的條件下培養(yǎng)10?12天，己酸菌濃度為1.5?2.5 X 10sCFU/mL，可以作為二級(jí)種子液使用，可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)接種；
(5)采用1000L酒缸作為培養(yǎng)容器，酒缸消毒采用酒精消毒方法，使用75%酒精2L，清洗缸體內(nèi)面反復(fù)2次，生產(chǎn)培養(yǎng)基配方如下:40?50斤大曲粉，2?2.5Kg碳酸鈣，4?5Kg乙酸鈉，350?450Kg酒尾，300?400Kg黃水，80?150Kg三級(jí)酒；按體積3%?5%的比例提取二級(jí)種子液，接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基中；添加順序?yàn)?先加入酒尾和黃水，測(cè)定酒度，根據(jù)酒度情況添加三級(jí)酒，最終保證生產(chǎn)培養(yǎng)基酒度控制在23?28度，然后添加大曲粉，再添加碳酸鈣和乙酸鈉，隨后使用乙醇滅菌的木棒攪拌，使添加的大曲粉分散，添加的鹽類(lèi)物質(zhì)溶解，最后加入二級(jí)種子液；溫度控制在30?35度，培養(yǎng)20?30天時(shí)，己酸菌濃度達(dá)到
5.0?9.0X 107CFU/mL時(shí)，制作成混合型己酸菌培養(yǎng)液。
[0011]所述混合型己酸菌培養(yǎng)液的應(yīng)用方法，在濃香型酒醅入池前取15?20Kg混合型己酸菌培養(yǎng)液潑灑于窖池壁；濃香型酒醅入池時(shí)，根據(jù)酒醅酸度、水分情況取0.5?2Kg培養(yǎng)液潑灑于入窖酒醅中，隨著逐層入窖可逐層潑灑。
[0012]所述混合型己酸菌培養(yǎng)液的再生產(chǎn)方法，當(dāng)1000L培養(yǎng)液剩余400?500L時(shí)，可繼續(xù)補(bǔ)齊培養(yǎng)液，添加配方如下:10?15斤大曲粉，0.5?1.5Kg碳酸鈣，1?2Kg乙酸鈉，150?250Kg酒尾，150?200Kg黃水，30?lOOKg三級(jí)酒；添加順序?yàn)?先加入酒尾和黃水，測(cè)定酒度，根據(jù)酒度情況添加三級(jí)酒，最終保證培養(yǎng)基酒度控制在23?28度，然后添加大曲粉，再添加碳酸鈣和乙酸鈉，隨后使用乙醇滅菌的木棒攪拌，使添加的大曲粉分散，使添加的鹽類(lèi)物質(zhì)溶解，溫度控制在30?35度，培養(yǎng)5?7天時(shí)，己酸菌濃度達(dá)到5.0?9.0X107CFU/mL時(shí)，得到混合型己酸菌培養(yǎng)液，可以應(yīng)用于生產(chǎn)。
[0013]本發(fā)明的有益效果是來(lái)自本公司優(yōu)質(zhì)老窖池窖泥中篩選的CK-jl菌株為基礎(chǔ)，利用己酸菌的酯化能力將白酒生產(chǎn)中的酒尾、曲粉、三級(jí)酒等成分組合起來(lái)，一方面擴(kuò)培己酸菌，增加窖池中己酸菌的含量，另一方面也產(chǎn)生大量的己酸乙酯、己酸等有益微量成分。該培養(yǎng)液可以用來(lái)保養(yǎng)窖池，可以起到防止窖泥退化作用，在濃香型白酒酒醅中潑灑可以在生產(chǎn)過(guò)程中增加白酒己酸乙酯等微量成分含量，增強(qiáng)濃香型白酒口感。通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，添加該培養(yǎng)液的白酒中己酸乙酯含量大幅度提高，優(yōu)質(zhì)白酒選取率提高5.8%，并且優(yōu)質(zhì)白酒口感經(jīng)品評(píng)較未使用窖池白酒等級(jí)有明顯提高，窖泥未出現(xiàn)板結(jié)和退化現(xiàn)象，本發(fā)明符合科學(xué)規(guī)律、生產(chǎn)成本低、操作簡(jiǎn)單，適合己酸菌培養(yǎng)液生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1，混合型己酸菌培養(yǎng)液的生產(chǎn)方法，包括如下步驟:
(1)培養(yǎng)基配方如下:1000mL水，乙酸鈉8g,硫酸鎂0.3g，硫酸錢(qián)0.8g，酵母膏1.5g，磷酸氫二鉀0.6g，1.5g碳酸鈣(單獨(dú)滅菌)，20mL乙醇(不滅菌單獨(dú)加入)；
(2)121°C度下，培養(yǎng)基滅菌20分鐘;
(3)將己酸菌(CK-jl)接種于培養(yǎng)基中，接種容器為若干250mL三角瓶，碳酸鈣、乙醇加入培養(yǎng)基，每個(gè)250mL三角瓶需加入15mL的己酸菌菌種，接種后需將沒(méi)有接種的培養(yǎng)基加入到已經(jīng)接種的三角瓶中，以液面在三角瓶口頸部離三角瓶頂端瓶口 4cm為宜，接種后采用液體石蠟液封培養(yǎng)，石蠟的使用量為1?1.5mL，接種三瓶，每瓶300?310mL，在33?34°C條件下活化培養(yǎng)7天，制得己酸菌種子液，己酸菌濃度為1.5?5.0X 10sCFU/mL，可以作為一級(jí)種子液使用；
(4)按體積5%的比例提取一級(jí)種子液，接種于二級(jí)己酸菌菌種培養(yǎng)基中，接種容器為若干5L三角瓶，二級(jí)己酸菌菌種培養(yǎng)基配方同上述培養(yǎng)基的配方，碳酸鈣、乙醇加入培養(yǎng)基，每個(gè)5L三角瓶需加入300mL的一級(jí)種子液，接種后需將沒(méi)有接種的培養(yǎng)基加入到已經(jīng)接種的三角瓶中，以液面在三角瓶口頸部離三角瓶頂端瓶口 4cm為宜，接種后采用液體石蠟液封培養(yǎng)，石蠟的使用量為2.5?3mL，將接種后的二級(jí)己酸菌菌種培養(yǎng)基在33?34°C的條件下培養(yǎng)10天，己酸菌濃度為1.5?2.5X 10sCFU/mL，可以作為二級(jí)種子液使用，可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)接種；
(5)采用1000L酒缸作為培養(yǎng)容器，酒缸消毒采用酒精消毒方法，使用75%酒精2L，清洗缸體內(nèi)面反復(fù)2次，生產(chǎn)培養(yǎng)基配方如下:40斤大曲粉，2Kg碳酸鈣，4Kg乙酸鈉，350Kg酒尾，300Kg黃水，80Kg三級(jí)酒；按體積3%的比例提取二級(jí)種子液，接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基中；添加順序?yàn)?先加入酒尾和黃水，測(cè)定酒度，根據(jù)酒度情況添加三級(jí)酒，最終保證生產(chǎn)培養(yǎng)基酒度控制在23度，然后添加大曲粉，再添加碳酸鈣和乙酸鈉，隨后使用乙醇滅菌的木棒攪拌，使添加的大曲粉分散，添加的鹽類(lèi)物質(zhì)溶解，最后加入二級(jí)種子液；溫度控制在30?32°C，培養(yǎng)30天時(shí)，己酸菌濃度達(dá)到5.0?9.0X 107CFU/mL時(shí)，制作成混合型己酸菌培養(yǎng)液。
[0015]所述混合型己酸菌培養(yǎng)液的應(yīng)用方法，在濃香型酒醅入池前取20Kg混合型己酸菌培養(yǎng)液潑灑于窖池壁；濃香型酒醅入池時(shí)，根據(jù)酒醅酸度、水分情況取1.5Kg培養(yǎng)液潑灑于入窖酒醅中，隨著逐層入窖可逐層潑灑。
[0016]所述混合型己酸菌培養(yǎng)液的再生產(chǎn)方法，當(dāng)1000L培養(yǎng)液剩余500L時(shí)，可繼續(xù)補(bǔ)齊培養(yǎng)液，添加配方如下:10斤大曲粉，0.5Kg碳酸鈣，lKg乙酸鈉，150Kg酒尾，150Kg黃水，30Kg三級(jí)酒；添加順序?yàn)?先加入酒尾和黃水，測(cè)定酒度，根據(jù)酒度情況添加三級(jí)酒，最終保證培養(yǎng)基酒度控制在25?26度，然后添加大曲粉，再添加碳酸鈣和乙酸鈉，隨后使用乙醇滅菌的木棒攪拌，使添加的大曲粉分散，使添加的鹽類(lèi)物質(zhì)溶解，溫度控制在34?35°C，培養(yǎng)5天時(shí)，己酸菌濃度達(dá)到5.0?9.0X 107CFU/mL時(shí)，得到混合型己酸菌培養(yǎng)液，可以應(yīng)用于生產(chǎn)。
[0017]實(shí)施例2，混合型己酸菌培養(yǎng)液的生產(chǎn)方法，包括如下步驟:
(1)培養(yǎng)基配方如下:1000mL水，乙酸鈉10g,硫酸鎂0.4g，硫酸錢(qián)lg，酵母膏2.5g，磷酸氫二鉀0.8g，2.5g碳酸鈣(單獨(dú)滅菌)，25mL乙醇(不滅菌單獨(dú)加入)； (2)121°C度下，培養(yǎng)基滅菌20分鐘;
(3)將己酸菌(CK-jl)接種于培養(yǎng)基中，接種容器為若干250mL三角瓶，碳酸鈣、乙醇加入培養(yǎng)基，每個(gè)250mL三角瓶需加入20mL的己酸菌菌種，接種后需將沒(méi)有接種的培養(yǎng)基加入到已經(jīng)接種