胞、SP2/0細(xì)胞、L5. 1細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞或人類細(xì)胞。
[0045] 待用根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞可以是正常細(xì)胞、患病細(xì)胞、經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、突 變細(xì)胞、體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、干細(xì)胞、前體細(xì)胞或胚胎細(xì)胞，所述任一細(xì)胞可以是建立的或者 經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系或者獲自天然來源的細(xì)胞。
[0046] 不含蛋白胨或胰蛋白胨的細(xì)胞培養(yǎng)基是不含任何蛋白胨或胰蛋白胨或者通過蛋 白的部分水解產(chǎn)生的其他肽的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0047] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不含蛋白胨或胰蛋白胨的細(xì)胞培養(yǎng)基也不包含任何蛋白質(zhì) 或其他天然來源的聚合物如瓊脂。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，不含蛋白胨或胰蛋白胨的細(xì) 胞培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定成分的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0048] 在化學(xué)上確定成分的細(xì)胞培養(yǎng)基是不含任何在化學(xué)上未確定成分的物質(zhì)的細(xì)胞 培養(yǎng)基。這指的是在化學(xué)上確定成分的培養(yǎng)基中所使用的化學(xué)組成和全部化學(xué)品的結(jié)構(gòu)都 是已知的。在化學(xué)上確定成分的培養(yǎng)基不含任何酵母、動(dòng)物或植物組織；它們不含飼養(yǎng)細(xì) 胞、血清、提取物或消化物或者可能有助于將在化學(xué)上未確定成分的蛋白質(zhì)引入至培養(yǎng)基 中的其他組分。在化學(xué)上未確定或未完全確定的化學(xué)結(jié)構(gòu)是化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)未知的那些化 學(xué)結(jié)構(gòu)，或者只能用大量的實(shí)驗(yàn)嘗試確定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)如白蛋白或酪蛋白的化學(xué) 組成和結(jié)構(gòu)的評(píng)定相當(dāng)。
[0049] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明不含蛋白胨或胰蛋白胨的細(xì)胞培養(yǎng)基僅含有一種 或多種糖類組分、一種或多種氨基酸、一種或多種維生素、一種或多種鹽、一種或多種緩沖 劑組分、一種或多種輔因子以及一種或多種核酸組分。
[0050] 顆粒大小指的是顆粒的平均直徑。顆粒直徑通過在硅油中的激光散射測(cè)定。
[0051] 糖類組分是全部單糖或二糖，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖（單糖的實(shí)例）或者 蔗糖、乳糖或麥芽糖（二糖的實(shí)例）。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明氨基酸的實(shí)例是蛋白（proteinogenic)氨基酸，特別是必需氨基酸， 亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸，以及非蛋白氨基 酸如D-氨基酸。
[0053] 維生素的實(shí)例是維生素A(視黃醇、視黃醛、多種類視黃醇和四種類胡蘿卜素）、 維生素匕（硫胺素）、維生素B2 (核黃素）、維生素B3 (煙酸、煙酰胺）、維生素B5 (泛酸）、維 生素B6(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛）、維生素B7(生物素）、維生素B9(葉酸、亞葉酸）、維生素 B12 (氰鈷氨素、羥鈷胺素、甲基鈷胺素）、維生素C(抗壞血酸）、維生素D(麥角鈣化醇、膽鈣 化醇）、維生素E(生育酚、生育三烯酚）和維生素K(葉綠醌、甲基萘醌類）。還包括維生素 前體。
[0054] 鹽的實(shí)例是包含無機(jī)離子的組分例如碳酸氫鹽、鈣鹽、氯化物、鎂鹽、磷酸鹽、鉀鹽 和鈉鹽或者包含微量元素如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V和Ζη的組分。
[0055] 緩沖劑的實(shí)例是C02/HC03、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。
[0056] 輔因子的實(shí)例是硫胺素衍生物、生物素、維生素C、NAD/NADP、鈷胺素、黃素單核苷 酸及衍生物、谷胱甘肽、血紅素核苷酸磷酸及衍生物。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明的核酸組分是核堿基，如胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶， 核苷如胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和胸苷，以及核苷酸如腺苷一磷酸或腺苷二磷酸或腺苷三磷 酸。
[0058] 穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)基是指這樣的培養(yǎng)基，與用相同配方的新鮮制備的培養(yǎng)基相比 較，在貯藏一段時(shí)間后的所述培養(yǎng)基仍顯示出至少80 %，優(yōu)選地至少90 %，更優(yōu)選地至少 97 %，最優(yōu)選地相同的生物學(xué)和生物化學(xué)活性。
[0059] 本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)：也可以以干的顆粒狀形式提供不含蛋白胨或胰蛋白胨或者 相似組分的培養(yǎng)基。這是非常出乎意料的，因?yàn)榈侥壳盀橹梗挥芯哂械鞍纂嘶蛞鹊鞍纂说?細(xì)胞培養(yǎng)基可以是干的顆粒狀。認(rèn)為蛋白胨或胰蛋白胨的粘著性質(zhì)對(duì)于干的顆粒狀培養(yǎng)基 的廣生是必需的。
[0060] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特定的壓實(shí)方法使得也能產(chǎn)生不含蛋白胨或胰蛋白胨的干顆粒狀培養(yǎng) 基。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的壓實(shí)方法以兩個(gè)基本步驟實(shí)施：
[0062] a)以培養(yǎng)基組分的混合粉末形式提供細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0063] b)在輥式壓制機(jī)中壓實(shí)所述混合的粉末。
[0064] 在步驟a)中，提供了培養(yǎng)基組分的細(xì)磨干粉。徹底混合全部組分，以使粉末混合 物的所有部分都具有幾乎相同的組成。就組成的均一性而言，該混合物應(yīng)當(dāng)具有與商品化 的干粉細(xì)胞培養(yǎng)基相同的品質(zhì)。就均一的細(xì)胞生長(zhǎng)而言，組合物的均一性越高，得到的干 顆粒狀培養(yǎng)基的品質(zhì)越好。適合于產(chǎn)生細(xì)磨粉末的研磨機(jī)例如是球磨機(jī)、臥式研磨機(jī)、噴 射式磨機(jī)或旋轉(zhuǎn)式葉片篩磨機(jī)（rotatingbladesievemill)。粉末的顆粒大小通常低于 500μm，優(yōu)選地低于200μm。
[0065] 為了提供培養(yǎng)基組分的混合粉末，可以例如首先將組分混合，然后細(xì)磨成混合物， 或者可以將它們單獨(dú)地或者以亞組研磨，然后組合和混合。
[0066] 優(yōu)選地，混合物的全部組分都是干的。這意味著，如果它們包含水，那么它們僅 包含結(jié)晶的水，并且按未結(jié)合的或者未配位的（uncoordinated)水分子的重量計(jì)，不超過 5 %，優(yōu)選地不超過2 %，最優(yōu)選地不超過1 %。
[0067] 如果一種或多種混合物組分對(duì)氧化是敏感的，那么可以在惰性保護(hù)氣體下進(jìn)行混 合和研磨
[0068] 在第二步（步驟b))中，粉末混合物是在輥式壓制機(jī)中壓實(shí)的。
[0069] 輥式壓制機(jī)，也稱為輥式壓實(shí)機(jī)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通常，輥式壓制機(jī)包 含兩個(gè)反向旋轉(zhuǎn)的輥，其位于相互約〇. 5-3mm，優(yōu)選地l-2mm的小距離。合適的輥式壓制機(jī) 通常具有10至50cm之間寬度的輥，導(dǎo)致輥之間的空隙具有10至50cm的長(zhǎng)度。然而，取決 于輥式壓制機(jī)的大小，輥的大小和由此導(dǎo)致的輥之間的空隙的長(zhǎng)度可以變化。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，該空隙具有10至15cm之間的長(zhǎng)度。
[0070] 將混合的粉末物質(zhì)在反向旋轉(zhuǎn)的輥之間抽出，并在輥之間的空隙中壓實(shí)。輥與其 表面結(jié)構(gòu)之間的距離對(duì)得到的顆粒狀微粒的最終大小和結(jié)構(gòu)具有影響。
[0071] 輥的表面優(yōu)選地是槽溝狀的。槽溝幫助使粉末與輥粘著，并通過擠壓將其拉伸。
[0072] 輥式壓制機(jī)的擠壓能力通常在20至150kN/cm輥寬之間，優(yōu)選地用30至80kN之 間，最優(yōu)選地在40至60kN之間的力一起擠壓輥。
[0073] 如果細(xì)胞培養(yǎng)基的組分是非常敏感的，那么可以在惰性保護(hù)氣體環(huán)境下進(jìn)行壓實(shí) 步驟。此外，因?yàn)橐恍┙M分通常是熱敏感的，并且將經(jīng)受不住由于壓實(shí)可能產(chǎn)生的輕微增高 的溫度，所以通常冷卻輥式壓制機(jī)的輥，以維持恒定的溫度。
[0074] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，直接測(cè)量從輥式壓制機(jī)中釋放的經(jīng)壓實(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)基的大 小。這可以例如通過，如用一個(gè)或多個(gè)振動(dòng)篩來篩濾進(jìn)行。篩子中孔的直徑取決于待收集 的顆粒的大小。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的方法，一般的直徑在〇.5-5mm之間，優(yōu)選地約1-3_。特 別地，如果輥式壓制機(jī)中的干顆粒形成了更大的壓實(shí)物或者薄片，優(yōu)選地將篩磨機(jī)（sieve mill)用于使壓實(shí)物或薄片成為合適大小的顆粒。一種合適的篩磨機(jī)是具有l(wèi)-3mm篩眼孔 徑的振動(dòng)篩磨機(jī)，型號(hào)FC200、BepexGmbH。
[0075] 適合于根據(jù)本發(fā)明方法的輯式壓制機(jī)可以例如購自Alexanderwerk，Sahut Coreur，Hosokawa或Fitzpatrick公司。
[0076] 如已說明，干的顆粒狀細(xì)胞培養(yǎng)基的顆粒大小取決于處理從輥式壓制機(jī)中出來的 經(jīng)壓實(shí)培養(yǎng)基的方式。如果從輥式壓制機(jī)中直接收集培養(yǎng)基，那么其通常包含較大的壓實(shí) 物或薄片。如果篩濾培養(yǎng)基，那么可以通過篩孔大小測(cè)定顆粒大小。但是，進(jìn)一步的處理如 包裝通常也會(huì)影響平均顆粒大小，因?yàn)轭w粒狀細(xì)胞培養(yǎng)基的一些顆?？赡芷屏殉伤槠?。
[0077] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在壓實(shí)和篩濾后，顆粒狀細(xì)胞培養(yǎng)基的80%以上的顆粒具 有大于0. 5mm的大小。
[0078] 在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，顆粒狀細(xì)胞培養(yǎng)基的90%以上的顆粒具有大于0. 5mm的大小。
[0079] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果將從輥式壓制機(jī)中釋放的具有小于0. 5,優(yōu)選地小于0. 2mm的顆粒 大小的經(jīng)壓實(shí)的培養(yǎng)基的級(jí)分連續(xù)地再引入到輥式壓制機(jī)的進(jìn)料物中，以再次與粉末混合 物再混合并再擠壓，那么可以進(jìn)一步改善根據(jù)本發(fā)明顆粒狀細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量。這減少了 最終的干的顆粒狀細(xì)胞培養(yǎng)基的粉末部分，并額外地改善了產(chǎn)品的均一性。
[0080] 圖1給出了一種可能的生產(chǎn)組裝的示意圖。輥式壓制機(jī)顯示為輥R1和輥R2。將 粉末混合物P1從儲(chǔ)罐進(jìn)料到輥式壓制機(jī)中。用篩子S篩分從輥式壓制機(jī)中釋放的經(jīng)壓實(shí) 的混合物。移除產(chǎn)物級(jí)分，用于進(jìn)一步的處理和包裝，將具有低于〇. 2_顆粒大小的粉末級(jí) 分P2連續(xù)地再引入到輥式壓制機(jī)的進(jìn)料中。
[0081] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以在不添加增加混合物的粘性的物質(zhì)的情況下進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的干 顆粒形成。
[0082] 然后可以進(jìn)一步加工得到的干的顆粒狀細(xì)胞培養(yǎng)基?？梢园b和/或滅菌培養(yǎng) 基。合適的容器是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。實(shí)例是袋子、盒子、瓶子、硬紙盒、真空包裝形式 等?？梢栽跍缇盎蛑筮M(jìn)行包裝。