一種山羊骨骼肌特異性基因actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種山羊骨骼肌特異性基因actin啟動 子驅(qū)動的Fat-Ι表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在基因工程中，要想得到大量純化的目的蛋白質(zhì)，需要構(gòu)建一種能夠高水平表達(dá) 外源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。而構(gòu)建高效的表達(dá)載體選擇要綜合多方面的因素。啟動子對外源 基因的表達(dá)影響很大，是表達(dá)載體的一個重要元件。啟動子嚴(yán)格調(diào)控著基因表達(dá)的時間和 空間位置。啟動子與受體細(xì)胞之間良好的兼容性對外源基因的表達(dá)有重要作用。同時，出于 高水平表達(dá)的要求，這種啟動子最好有較強(qiáng)的啟動活性，并具有良好的調(diào)控系統(tǒng)。因此，構(gòu) 建包含合適啟動子的載體，可以提高外源基因表達(dá)效率。隨著基因治療的發(fā)展，目的基因在 病人體內(nèi)的表達(dá)要求嚴(yán)格的時間和空間位置。組織器官特異性啟動子的研究使得該方法有 了很大進(jìn)步，根據(jù)需要來構(gòu)建合適的組織特異性啟動子載體，不僅便于研究新基因的功能， 還可闡明生物的生長、發(fā)育、分化及繁殖過程與機(jī)理，在特定的部位或發(fā)育階段生產(chǎn)有用蛋 白質(zhì)或其它代謝產(chǎn)物，以實(shí)現(xiàn)對外源基因表達(dá)的定時、定點(diǎn)、定量二維精確調(diào)控。
[0003] 利用肌肉特異性啟動子，通過構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體，能夠開啟基因固定于肌肉中 表達(dá)。通過外源基因的蛋白或RNAs在山羊的骨骼肌中的表達(dá)可很好的研究肌肉的分化或 功能及改善肌肉的風(fēng)味、質(zhì)量。例如可利用肌肉特異性的啟動子攜帶目的MieroRNA特異性 的靜默其靶基因在肌肉中的表達(dá)而不影響其他組織的此基因的正常表達(dá)，有效的獲得目的 基因?qū)τ诩∪饨M織的作用；同時可以利用肌肉組織特異性的啟動子來研究那些通過QTL圖 譜定位及表達(dá)分析獲得的可用于提高肌肉量的候選基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種山羊骨骼肌特異性基因actin啟動子驅(qū)動的Fat-ι表 達(dá)載體。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種山羊骨骼肌特異性基因actin啟動子驅(qū)動的 Fat-1表達(dá)載體構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種山羊骨骼肌特異性基因actin啟動子驅(qū)動的Fat-Ι表達(dá)載體，該表達(dá) 載體是首先將Fat-Ι基因克隆入pEGFP-Nl載體，構(gòu)建成pEGFPNl-Fat-Ι載體，然后 將PCR擴(kuò)增得到的CMV增強(qiáng)子插入無啟動子和增強(qiáng)子的pEGFPNl-Fat-Ι載體，構(gòu)建 成pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體，最后將骨骼肌特異性基因a -actin啟動子插入 pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體中，構(gòu)建成的a -actin promoter-pEGFPNl-Fat-l表達(dá)載體。
[0008] 該表達(dá)載體的具體構(gòu)建過程為：
[0009] (1)利用平末端連接構(gòu)建pEGFPNl-Fat-Ι載體：
[0010] 將PCAGGS-Fat-1質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后回收Fat-ι基因，將pEGFP-Nl質(zhì)粒經(jīng)BamHI 酶切后回收線性化的pEGFP-Nl質(zhì)粒載體，將回收后的Fat-1基因和線性化的pEGFP-Nl質(zhì) 粒載體的cDNA末端補(bǔ)平，進(jìn)行平末端連接構(gòu)建成pEGFPNl-Fat-Ι載體；
[0011] (2)構(gòu)建pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體：
[0012] 根據(jù)PCAGGS載體的CMV-Enhancer序列，設(shè)計(jì)一對含有特異性酶切位點(diǎn)的引 物，通過PCR方法擴(kuò)增CMV-Enhancer基因，然后與ρΜβ? 19-T Vector連接得到pMD? 19-T-CMV-enhancer載體，利用Sail和Asel雙酶切 19-T-CMV-enhancer載體 并回收酶切產(chǎn)物CMV-Enhanc er基因片段，將酶切產(chǎn)物定向克隆到無啟動子和增強(qiáng)子的pEGFPNl-Fat-1載體質(zhì)粒中，構(gòu)建成pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體；
[0013] 所述的含有特異性酶切位點(diǎn)的引物為：
[0014] Enhancer-F ：GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC
[0015] Enhancer-R ：GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG
[0016] (3)構(gòu)建a -actin promoter-pEGFPNl-Fat-l表達(dá)載體：
[0017] 采用分段PCR擴(kuò)增的方法，分別從羊肌肉組織DNA中擴(kuò)增1824bp和1347bp兩片段 Parti和Part2,同時首尾相連插入pEGFPNl-Fat-1-Ehancer質(zhì)粒同一位置構(gòu)建成a -actin promoter-pEGFPNl-Fat-Ι表達(dá)載體；各片段引物為：
[0022] 作為一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟（3)中擴(kuò)增Part2時，添加PCREnhancer或DMS0進(jìn) 行擴(kuò)增優(yōu)化。
[0023] 進(jìn)一步優(yōu)選為，擴(kuò)增Part2時，20 yL體系中添加0. 6~0. 8 yLDMSO進(jìn)行擴(kuò)增。
[0024] 本發(fā)明選擇山羊的骨骼肌特異性表達(dá)基因a -actin的啟動子作為研究的對象， 旨在分離獲得此基因的調(diào)控序列，瞬時轉(zhuǎn)染不同類型的細(xì)胞，分析其調(diào)控能力的強(qiáng)弱，以期 獲得具備較高活性同時又保持肌肉組織特異性的載體，為未來在基因工程中的應(yīng)用打下基 礎(chǔ)。
[0025] 本發(fā)明的有益效果：
[0026] 本發(fā)明的a -actin表達(dá)載體為骨骼肌特異性表達(dá)載體，能夠滿足下游基因在骨 骼肌中特異性表達(dá)的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。
【附圖說明】
[0027] 圖1為骨骼肌特異性基因a -actin啟動子驅(qū)動的Fat-Ι基因表達(dá)載體的構(gòu)建示 意圖
[0028]圖 2 為EcoRI酶切pCAGGS-fat-I質(zhì)粒
[0029]圖 3 為BamHI酶切pEGFP-Nl質(zhì)粒
[0030] 圖4為pEGFPNl-Fat-Ι中Fat-Ι序列與EGFP連接處測序結(jié)果圖
[0031]圖 5 為CMV-Enhancer基因PCR擴(kuò)增圖
[0032] 圖6為CMV-Enhancer基因測序結(jié)果圖
[0033] 圖 7 為Asel、Sail雙酶切pMD? 19-T-CMV-enhancer
[0034] 圖 8 為Asel、Sail雙酶切Fatl-pEGFP-Nl載體
[0035] 圖9為a-actin基因PCR擴(kuò)增圖
[0036] A.PCR擴(kuò)增Parti;B.添加DMSO擴(kuò)增優(yōu)化Part2
[0037] 圖 10 為Sail酶切pEGFPNl-Fat-1-Ehancer
[0038] 圖11為重組片段定量
[0039] 注：圖中由灰色方框和白色方框，相同顏色方框表示DNA量大致相等。每個片段上 樣量為 1/2μ1、1/4μ1、1/8μ1。
[0040] Lanel:MarkerIII1μ1；Lane2:MarkerIII2μ1；Lane3:MarkerIII3μ1；
[0041] Lane4:MarkerIII4μ1；Lane5:MarkerIII5μ1
[0042] 圖 12 為a-actinpromoter-pEGFPNl-Fat-l的PCR鑒定圖
[0043] 0 :空載對照質(zhì)粒；1-10 :克隆
[0044] 圖13為四種細(xì)胞中a-actin驅(qū)動下的LUC的相對活性檢測
【具體實(shí)施方式】
[0045] 一、山羊骨骼肌特異性基因a-actin啟動子驅(qū)動的Fat-Ι表達(dá)載體的構(gòu)建
[0046] 本表達(dá)載體是首先將Fat-Ι基因克隆入pEGFP-Nl載體，構(gòu)建成pEGFPNl-Fat-1 表達(dá)載體，然后將PCR擴(kuò)增得到的CMV增強(qiáng)子插入無啟動子和增強(qiáng)子的pEGFPNl-Fat-1載 體，最后將骨骼肌特異性基因α-actin啟動子插入上步獲得的載體中，構(gòu)建成a-actin promoter-pEGFPNl-Fat-l載體。骨骼肌特異性基因a-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1基因表 達(dá)載體構(gòu)建示意圖見圖1。
[0047] 1.利用平末端連接構(gòu)建pEGFPNl-Fat-Ι載體
[0048] (1)按照如下表體系加入相應(yīng)的質(zhì)粒、內(nèi)切酶EcoRI、通用酶切緩沖液及超純水， 終體積為20μL。PCAGGS-Fat-Ι質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后電泳可見1. 3kb處目的條帶及PCAGGS 載體條帶（見圖2)。
[0049]
[0050] ⑵按照如下體系，pEGFP-Nl質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶切后電泳可見線性化的載體條帶 (見圖3)。
[0051]
[0052] (3)然后將切膠回收后的Fat-1和線性化pEGFP-Nl的cDNA末端按照如下體系 72°C45min補(bǔ)平。
[0053]PremixSTAR 25μL
[0054]Fat-1的cDNA /pEGFP-Nl的cDNA(已酶切） 20 μ L
[0055] ddH20 至50μL
[0056] (4)然后按照如下體系16°C過夜進(jìn)行平末端連接。
[0057]SolutionI 5μL
[0058]Fat-1 補(bǔ)平產(chǎn)物 1μL
[0059]pEGFP-Nl補(bǔ)平產(chǎn)物 4μL
[0060] (5)通過測序發(fā)現(xiàn)，pEGFPNl-Fat-1中Fat-1基因序列與EGFP連接處正確（見圖 4中的pEGFPNl-Fat-Ι中Fat-Ι序列與EGFP連接處測序結(jié)果圖）。
[0061] 2.pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體的構(gòu)建
[0062] 根據(jù)PCAGGS載體的CMV-Enhancer序列，設(shè)計(jì)了一對含有特異性酶切位點(diǎn)的引物， 通過PCR方法按照表1反應(yīng)體系擴(kuò)增了CMV-Enhancer基因，其長度分別為338bp，PCR反 應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min;98°C變性10s，56°C退火15s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；72°C 延伸lOmin。然后按照表2將上述產(chǎn)物與pMD?l9-TVector連接。對CMV-Enhancer基 因進(jìn)行測序后，與PCAGGS載體CMV-Enhancer序列做Blast，同源性為99. 8%。擴(kuò)增山羊 CMV-Enhancer基因的引物為：
[0063] Enhancer-F :GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC(引入AseI位點(diǎn)）
[0064]Enhancer-R:GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG(引入SalI位點(diǎn)）
[0065] 表1 PCR擴(kuò)增參數(shù)表
[0066]
[0067] 表2連接程序
[0068]
[0069]CMV-Enhance基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見338bp處 明亮特異的目的條帶（見圖5中的CMV-Enhancer基因PCR擴(kuò)增圖）。CMV-Enhancer基 因測序結(jié)果與PCAGGS載體CMV-Enhancer序列一致（見圖6中的CMV-Enhancer基因測 序結(jié)果圖）。利用PMD? 19-T-CMV-enhancer載體上自帶的Sal I和Ase I限制性內(nèi)切 酶酶切位點(diǎn)，利用Sal I和Ase I雙酶切pMDS19-T-CMV-enhancer載體并回收酶切產(chǎn)物 CMV-Enhancer基因片段（見圖7)，利用Ase I和Sal I雙酶切Fatl-pEGFP-Nl載體回收