線 性化的Fatl-pEGFP-Nl載體（見圖8);雙酶切體系如下。將酶切產(chǎn)物定向克隆到無啟動子 和增強子的pEGFPNl-Fat-1載體質(zhì)粒中，構(gòu)建成pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體。
[0070] 表3雙酶切反應體系
[0073] 3.a-actin promoter-pEGFPNl-Fat-l載體的構(gòu)建
[0074]SalI單酶切骨骼肌特異性基因a-actin啟動子的DNA，并插入到線性化的 pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體上，構(gòu)建成α-actinpromoter-pEGFPNl-Fat-l載體。經(jīng) 驗證無法直接擴增得到完整a-actin片段，因此采用分段PCR擴增的方法，分別從 羊肌肉組織DNA中擴增1824bp和1347bp兩片段Parti和Part2,同時首尾相連插入 pEGFPNl-Fat-1-Ehancer質(zhì)粒同一位置。各片段引物設(shè)計如下：
[0075]partIF:TCATCGCTATTACCAGTCGACAGCCCCCCTCACTATTCTTTT
[0076]partlR:CTGGGCAGCAGTTTTCCT
[0077]part2F:GAAAACTGCTGCCCAGCCTACAGTGCAACGTCCTTGTCTT
[0078] part2R:CGGGCCCGCGGTACCGTCGACAGGCTTCTCTCGGCGCTGTCCGCT
[0079] 按表4反應體系，98°C預變性3min;98°C變性10s，60°C退火15s，72°C延伸lmin， 共25個循環(huán)；72°C延伸lOmin進行PCR擴增制備兩段插入片段，膠回收備用。Parti不加 任何添加劑，直接擴增（見圖9A) ;Part2通過添加DMS0進行擴增優(yōu)化（見圖9B)，在20 μ L 體系中，添加0. 6 yL DMS0大量擴增制備該片段。
[0080] 表4兩片段PCR反應體系
[0081]
[0082] Sal I單酶切pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體，膠回收備用（見圖10)。
[0083] 分光光度計測DNA濃度誤差很大，且易受DNA純度的影響，因此，基因重組時，用電 泳比較亮度的方法對DNA進行定量。載體及目的片段和對應大小Marker條帶對照可知樣 品DNA濃度：Part1 :320ng/μL ;Part2 :320ng/μL;載體：120ng/μL(見圖 11) 〇
[0084] 線性化pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體和a-actin的兩部分片段在ExnaseTM催化 下，按表5反應體系，37°C，30min。置于冰水浴中5min后，進行轉(zhuǎn)化。挑取轉(zhuǎn)換平板10個 克隆，搖菌提取質(zhì)粒并鑒定（圖12為a-actinpromoter-pEGFPNl-Fat-1的PCR鑒定圖）。 然后挑取3個質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與GenBank報道序列一致。
[0085] 表5重組反應體系
[0086]
[0087] 注：線性化載體加0. 03pmol，插入片段加入0. 06pmol。根據(jù)lpmollbpdsDNA約 等于0· 66ng，得：
[0088]線性化載體=0· 03pmolΧ0· 66ng/pmol/bpX片段大?。╞p) = 0· 02ngX片段大 ?。╞p);
[0089]插入片段=0· 06pmolX0· 66ng/pmol/bpX片段大小（bp) = 0· 04ngX片段大小 (bp)；
[0090] 二、山羊骨豁肌特異性基因a-actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達載體的功能驗證
[0091] 本發(fā)明以海腎熒光素酶報告基因PRL-TK做內(nèi)參質(zhì)粒（用以校正轉(zhuǎn)染效率），以 Lipofectamine?2000做轉(zhuǎn)染試劑，將構(gòu)建的山羊骨豁肌特異性基因a -actin啟動子驅(qū)動 的Fat-1表達載體分別瞬時轉(zhuǎn)染山羊骨骼肌細胞，誘導分化的山羊骨骼肌細胞，另外一種 橫紋肌細胞一山羊心肌細胞，和骨骼肌來源于的間充質(zhì)干細胞，以空轉(zhuǎn)做對照，利用雙熒光 素酶報告基因檢測試劑盒對山羊骨骼肌特異性表達基因a-actin啟動子驅(qū)動的Fat-Ι表 達載體的活性及組織特異性進行分析，啟動子活性大小用相對活性表示：螢火蟲熒光素酶 的活性同內(nèi)參海腎熒光素酶的活性的比值。結(jié)果表明，該載體僅在誘導分化的山羊肌肉細 胞中表達，在未誘導分化山羊骨骼及細胞，心肌細胞和間充質(zhì)干細胞中并未檢測到熒光蛋 白，無啟動活性（見圖13為四種細胞中a-actin驅(qū)動下的LUC的相對活性檢測結(jié)果）。綜 上，a-actin表達載體為骨骼肌特異性表達載體，能夠滿足下游基因在骨骼肌中特異性表 達的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。
【主權(quán)項】
1. 一種山羊骨骼肌特異性基因 actin啟動子驅(qū)動的Fat-ι表達載體，其特征在于 該表達載體是首先將Fat-Ι基因克隆入pEGFP-Nl載體，構(gòu)建成pEGFPNl-Fat-Ι載體， 然后將PCR擴增得到的CMV增強子插入無啟動子和增強子的pEGFPNl-Fat-Ι載體，構(gòu) 建成pEGFPNl-Fat-1-Ehancer載體，最后將骨骼肌特異性基因 a -actin啟動子插入 pEGFPNl-Fat-1-Ehancer 載體中，構(gòu)建成的 a -actin promoter-pEGFPNl-Fat-l 表達載體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于該表達載體的具體構(gòu)建過程為： (1) 利用平末端連接構(gòu)建pEGFPNl-Fat-Ι載體： 將PCAGGS-Fat-Ι質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后回收Fat-Ι基因，將pEGFP-Nl質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶 切后回收線性化的pEGFP-Nl質(zhì)粒載體，將回收后的Fat-Ι基因和線性化的pEGFP-Nl質(zhì)粒 載體的cDNA末端補平，進行平末端連接構(gòu)建成pEGFPNl-Fat-Ι載體； (2) 構(gòu)建 pEGFPNl-Fat-1-Ehancer 載體： 根據(jù)PCAGGS載體的CMV-Enhancer序列，設(shè)計一對含有特異性酶切位點的引物， 通過PCR方法擴增CMV-Enhancer基因，然后與pMDiC 19-T Vector連接得到pM:D_: 19-T-CMV-enhancer 載體，利用 Sal I 和 Ase I 雙酶切 pMD.& 19-T-CMV-enhancer 載體 并回收酶切產(chǎn)物CMV-Enhanc er基因片段，將酶切產(chǎn)物定向克隆到無啟動子和增強子的 pEGFPNl-Fat-1 載體質(zhì)粒中，構(gòu)建成 pEGFPNl-Fat-1-Ehancer 載體； 所述的含有特異性酶切位點的引物為： Enhancer-F ：GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC Enhancer-R ：GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG (3) 構(gòu)建 a -actin promoter-pEGFPNl-Fat-Ι 表達載體： 采用分段PCR擴增的方法，分別從羊肌肉組織DNA中擴增1824bp和1347bp兩片段 Parti和Part2,同時首尾相連插入pEGFPNl-Fat-1-Ehancer質(zhì)粒同一位置構(gòu)建成a -actin promoter-pEGFPNl-Fat-Ι表達載體；各片段引物為： partIF:TCATCGCTATTACCAGTCGACAGCCCCCCTCACTATTCTTTT partlR:CTGGGCAGCAGTTTTCCT part2F:GAAAACTGCTGCCCAGCCTACAGTGCAACGTCCTTGTCTT part2R:CGGGCCCGCGGTACCGTCGACAGGCTTCTCTCGGCGCTGTCCGCT。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于步驟（3)中擴增Part2時，添加 DMS0 進行擴增優(yōu)化。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于擴增Part2時，20 μ L體系中添加 0· 6~0· 8 μ L DMS0進行擴增。5. 權(quán)利要求1所述山羊骨骼肌特異性基因 actin啟動子驅(qū)動的Fat-Ι表達載體的構(gòu)建 方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 利用平末端連接構(gòu)建pEGFPNl-Fat-Ι載體： 將PCAGGS-Fat-Ι質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切后回收Fat-Ι基因，將pEGFP-Nl質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶 切后回收線性化的pEGFP-Nl質(zhì)粒載體，將回收后的Fat-Ι基因和線性化的pEGFP-Nl質(zhì)粒 載體的cDNA末端補平，進行平末端連接構(gòu)建成pEGFPNl-Fat-Ι載體； (2) 構(gòu)建 pEGFPNl-Fat-1-Ehancer 載體： 根據(jù)PCAGGS載體的CMV-Enhancer序列，設(shè)計一對含有特異性酶切位點的引物， 通過PCR方法擴增CMV-Enhancer基因，然后與19-T Vector連接得到pMDfi): 19-T-CMV-enhancer 載體，利用 Sal I 和 Ase I 雙酶切 pVID、丨Γ 19-T-CMV-enhancer 載體 并回收酶切產(chǎn)物CMV-Enhanc er基因片段，將酶切產(chǎn)物定向克隆到無啟動子和增強子的 pEGFPNl-Fat-1 載體質(zhì)粒中，構(gòu)建成 pEGFPNl-Fat-1-Ehancer 載體； 所述的含有特異性酶切位點的引物為： Enhancer-F ：GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC Enhancer-R ：GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG (3)構(gòu)建 a -actin promoter-pEGFPNl-Fat-l 表達載體： 采用分段PCR擴增的方法，分別從羊肌肉組織DNA中擴增1824bp和1347bp兩片段 Parti和Part2,同時首尾相連插入pEGFPNl-Fat-1-Ehancer質(zhì)粒同一位置構(gòu)建成a -actin promoter-pEGFPNl-Fat-l表達載體；各片段引物為： partIF:TCATCGCTATTACCAGTCGACAGCCCCCCTCACTATTCTTTT partlR:CTGGGCAGCAGTTTTCCT part2F:GAAAACTGCTGCCCAGCCTACAGTGCAACGTCCTTGTCTT part2R:CGGGCCCGCGGTACCGTCGACAGGCTTCTCTCGGCGCTGTCCGCT。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟⑶中擴增Part2時，添加 DMS0進行 擴增優(yōu)化。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于擴增Part2時，20 μ L體系中添加 0. 6~ 0. 8yL DMS0進行擴增。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種山羊骨骼肌特異性基因actin啟動子驅(qū)動的Fat-1表達載體及其構(gòu)建方法，該表達載體是首先將Fat-1基因克隆入pEGFP-N1載體，構(gòu)建成pEGFPN1-Fat-1載體，然后將PCR擴增得到的CMV增強子插入無啟動子和增強子的pEGFPN1-Fat-1載體，構(gòu)建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體，最后將骨骼肌特異性基因α-actin啟動子插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體中，構(gòu)建成的α-actin？promoter-pEGFPN1-Fat-1表達載體。該表達載體具有較高活性同時又保持肌肉組織特異性，為未來在基因工程中的應用打下基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15/85, C12N15/66
【公開號】CN105274139
【申請?zhí)枴緾N201510502021
【發(fā)明人】樊懿萱, 王 鋒, 鐘部帥
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年8月14日