Proofmonoe虹ome，美國），PL303型電子天平（梅特勒-托利多儀 器有限公司），6219型電子抑計(jì)（上海任氏電子有限公司），3K30高速低溫離屯、機(jī)（sigma 公司），JloferMiniVE型western電泳印記系統(tǒng)（美國Amersham公司），SYC-2101水平搖床 (南京楊翔儀器設(shè)備有限責(zé)任公司），高速臺(tái)式離屯、機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），微 型電泳及電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司），S氣細(xì)胞培養(yǎng)箱1750型（法國Jouan公司）， M孤化5410純水器Milli-Qplus型（法國Millipore公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上 海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），SHW-I型恒溫磁力攬拌器（杭州儀表電機(jī)廠），YG-875B超凈工作臺(tái) (蘇州醫(yī)療設(shè)備廠），連續(xù)波長酶標(biāo)儀度enchnlarkPlusTM,Bio-RAD公司），倒置顯微鏡 (日本Nicon公司），全自動(dòng)滅菌鍋（日本Sanyo公司），臺(tái)式低溫高速離屯、機(jī)度echman公 司），電泳儀（P0werPAL3000,Bio-RAD公司），DU640型紫外分光光度計(jì)（美國Beeklllan 公司）。
[002引 二、試驗(yàn)方法
[0030] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0031] 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞W常規(guī)方法復(fù)蘇后使用DMEM培養(yǎng)基（含10%FB巧培養(yǎng)。 細(xì)胞W60mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)，加入3mLDMEM完全培養(yǎng)基。細(xì)胞長至80%融合時(shí)，WHankS平 衡鹽溶液（皿S巧沖洗兩遍，改W不含血清的DMEM培養(yǎng)至藥物處理前。
[0032] 2、化合物（I)的處理
[0033] 化合物（I)先WDMS00. 1血溶解后均勻分散于DMEM不完全培養(yǎng)基中。最終處 理細(xì)胞的化合物（I)濃度為100,500,1500 ^111〇1/1，處理化后繼續(xù)予W缺氧培養(yǎng)。
[0034] 3、化合物（I)體外抑制細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0035] 文獻(xiàn)報(bào)道化合物（I)在50ymol/L濃度范圍內(nèi)，對SMMC7721細(xì)胞既無顯著的 生長抑制，也不顯著增加流式細(xì)胞儀檢測中的調(diào)亡率。本研究選擇0-200ymol/L濃度的 化合物（I)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在96孔板中分別加入不同濃度化合物（I)100^以使藥物終 濃度為 5Jimol/X、10Jimol/X、25Jimol/X、50Jimol/X、100Jimol/X、200Jimol/L每濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，陽性藥對照組加入5-氣尿喀晚巧-Fluorouracil，5-FU) 10Jig/mU對照孔加入等 體積DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)后取指數(shù)生長期細(xì)胞用完全DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至（1~ 。X1〇5個(gè)/mL,每孔接種細(xì)胞懸液100yL。培養(yǎng)4化后，WMTT法檢測細(xì)胞增殖程度，每孔 加入2. 5mg/mLMTT20yL，繼續(xù)培養(yǎng)地，離屯、后小屯、棄去培養(yǎng)液，每孔加入150yLDMS0,在 震蕩器上震蕩IOmin后于酶標(biāo)儀中W570nm波長檢測，測定各孔的光密度值（OD)，抑制率按 下列公式計(jì)算：抑制率（％) = (1-加藥孔平均OD值/對照孔平均OD值）X100%。
[0036] 4、化合物（I)體內(nèi)抑制裸小鼠U251移植性肉瘤生長實(shí)驗(yàn)
[0037] 體外培養(yǎng)的U251細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，選擇生長最佳狀態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)體系，離屯、， 用生理鹽水按體積比1:3(腫瘤細(xì)胞：生理鹽水）稀釋混勻。用ImL-次性注射器吸取 上述細(xì)胞懸液0. 15111以穿過小鼠右后肢大腿肌肉接種于腹股溝皮下，然后隨機(jī)分為空白 組扣ntreated，等容積NS)、溶劑對照組（vehide，等容積NS+DMS0)、化合物（I)1. 0， 2.Ommol/kg腹腔注射組，每組6只，按0. 1血/IOg體重給藥，環(huán)憐獻(xiàn)胺（切elo地OS地amide, CT訝陽性對照組為0.02g/kg體重腹腔注射給藥。一天一次，連續(xù)給藥IOd后處死小鼠，分 離腫瘤稱重。抑瘤率（％) =a-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重）X100%。
[0038] 5、統(tǒng)計(jì)分析
[0039] 采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)W姑.S表示，經(jīng)one-wayANOVA(多重比較用 LSD法）、independentsamplest-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，具體見各數(shù)據(jù)表格和圖表，W P《0. 05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0040]S、結(jié)果及結(jié)論
[0041] 1、化合物（I)單藥處理對U251細(xì)胞增殖的影響
[004引用MTT檢測法檢測各孔在570nm下的吸光度值（optiealdensity,OD日7。），W此反 映U251細(xì)胞增殖的活性。各組0057。值經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，P= 0. 460,說明方差齊性；經(jīng)單 向方差分析，F(xiàn)= 57. 577,P= 0. 121，說明組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示化合物（I) 體外在《200ymol/L給藥濃度下對U251細(xì)胞的增殖沒有抑制作用。結(jié)果見表1 (one-way ANOVAiP= 0. 121 ^ 0. 05) 0
[0043] 2、化合物（I)單藥處理對荷瘤小鼠的抑瘤作用
[0044] 各組瘤重值經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，F(xiàn)= 1. 903,P= 0. 141，說明方差齊性；經(jīng)單向方 差分析，F(xiàn)= 17. 931，P= 0. 000,說明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需要進(jìn)一步采用LSD檢 驗(yàn)方法行多重比較?；衔铮↖)劑量為1.0,2.Ommol/kg腹腔注射組的處理組與溶劑 對照組（Vehiele)比較，P值分別為：0.000,0. 000,說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示通過腹 腔注射給藥，化合物（I)對荷U251作用，抑瘤作用有隨劑量增加而增強(qiáng)趨勢。見表 2 (LSDtest:沖《0.05VSVehiclegroup)。
[0045] 結(jié)論，化合物（I)單藥處理對U251細(xì)胞增殖作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物（I) 體外對U251細(xì)胞的增殖沒有抑制作用，說明在一定劑量范圍內(nèi)的化合物（I)處理對腫瘤 細(xì)胞的生長沒有明顯的影響，提示化合物（I)對U251細(xì)胞沒有直接的細(xì)胞毒或誘導(dǎo)細(xì)胞 調(diào)亡作用。而在化合物（I)對荷U251實(shí)體瘤裸小鼠的抑瘤作用實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)化合物（I) 劑量為I. 0,2.Ommol/kg時(shí)，對荷U251實(shí)體瘤裸小鼠表現(xiàn)出一定的抑瘤作用，且抑瘤作用隨 劑量增加而增強(qiáng)。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明化合物（I)具有一定的抗U251腫瘤作用，其 作用是通過細(xì)胞毒或者誘導(dǎo)調(diào)亡W外的某種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。
[0046] 表1化合物（I)對U251人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖的作用（n=6,占S)
[0048] 表2化合物（I)腹腔注射給藥對荷U251實(shí)體瘤裸小鼠的抑瘤作用（n=6, :?? )
[0050] 實(shí)施例3
[0051] 片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[00閲 實(shí)施例4
[0053] 口服液制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成 口服液。
[0054] 實(shí)施例5
[0055]膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[005引 實(shí)施例6
[0057]注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[00則實(shí)施例7
[0059] 無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無菌 烙封得粉針劑。
[0060] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a)將 苦石蓮的干燥成熟種子粉碎，用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱 體積，再用70 %乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫物 浸膏；（c)步驟（b)中70%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、 30:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4用正 相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3 個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合 物（I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：步驟（a)中，用75% 乙醇熱回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為AB-8 型大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物，其特征在于：該藥物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的 化合物（I)和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種克羅烷型二萜化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。該化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的二萜類化合物，可以從苦石蓮的干燥成熟種子中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物具有抗人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251作用，可以用來開發(fā)成治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物。
【IPC分類】C07D493/10, A61P35/00, A61K31/366
【公開號】CN105294724
【申請?zhí)枴緾N201510676623
【發(fā)明人】田麗華
【申請人】淄博夸克醫(yī)藥技術(shù)有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年10月16日