一種沉默水稻過(guò)氧化氫酶基因OSCAT1的sgRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種抑制OSCATl基因表達(dá)的SgRNA及應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 過(guò)氧化氨酶（Catalase,CAT)是一種四聚體血紅素酶，也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抗氧 化酶，在植物體中主要存在于葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。按照催化中屯、結(jié)構(gòu)差異可分為兩 類：（1)含鐵化嘟結(jié)構(gòu)CAT,又稱鐵化嘟酶（FeCAT) ; (2)含儘化嘟結(jié)構(gòu)CAT,即儘離子代替鐵 離子，又稱儘過(guò)氧化氨酶（MnCAT)。CAT的主要功能是催化&〇2分解為H2〇與〇2,減少&〇2 與化在鐵馨合物作用下反應(yīng)生成對(duì)植物有害的'0H。
[0003] 隨著研究的不斷深入，過(guò)氧化氨酶在植物防御、脅迫應(yīng)答W及控制細(xì)胞的氧化還 原平衡等方面起著重要的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注，其抗低溫、干旱、病毒W(wǎng)及除草劑的 功能已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物中得到驗(yàn)證。DatjF等的研究發(fā)現(xiàn)在CAT基因缺失的煙草中，&〇2含 量升高，并產(chǎn)生類似于調(diào)亡的細(xì)胞死亡。Talarczyk等人在煙草中過(guò)量表達(dá)酵母OsCATl, 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株抗病毒侵染能力提高，產(chǎn)生的壞死斑比未轉(zhuǎn)基因植物小。Miyagawa 等的研究發(fā)現(xiàn)在煙草中過(guò)量表達(dá)大腸桿菌巧scherichiacoli)過(guò)氧化氨酶基因后，其植株 葉綠體內(nèi)的過(guò)氧化氨酶表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)光、干旱和除草劑等誘導(dǎo)的氧化脅迫的抗性。李思義 將小麥的過(guò)氧化氨酶導(dǎo)入水稻中，獲得過(guò)氧化氨酶高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻。運(yùn)些轉(zhuǎn)基因水 稻的過(guò)氧化氨酶活性增強(qiáng)，從而提高了對(duì)低溫傷害的耐性。Polidoros等將玉米CAT2基因 轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)除草劑引起的傷害抗性增強(qiáng)，說(shuō)明過(guò)氧化氨酶也能提 高植物對(duì)除草劑的抗性。
[0004]CRISPR/tas9是一種來(lái)源于原核生物的新型核酸酶系統(tǒng)，它由導(dǎo)向序列SgRNA和 核酸酶化s9兩種元件組成。SgRNA可識(shí)別基因組中特定核甘酸序列并對(duì)其進(jìn)行切割造成雙 鏈DNA斷裂值OUble-Strandbreaks,DSB)，在沒(méi)有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末端連 接（Non-homologousendjoining，畑EJ),造成移碼突變（frameshiftmutation),導(dǎo)致基 因沉默。運(yùn)一技術(shù)由于能快速、簡(jiǎn)便、高效地祀向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關(guān)注， [000引精確祀向目標(biāo)基因是CRISPR-化s9能否特異性沉默目標(biāo)基因的先決條件，無(wú)論是 脫祀還是錯(cuò)誤祀向，都會(huì)影響CRISPR-化s9對(duì)目標(biāo)基因的特異性沉默。因此，能夠設(shè)計(jì)、審U 備出精確性和特異性祀向目標(biāo)基因的SgRNA成為CRISPR-化s9基因沉默的關(guān)鍵技術(shù)。
[0006]水稻（化yzasativaL.)是最主要的糧食作物之一，全世界超過(guò)一半的人口都W 水稻作為主糧。水稻不僅是一種重要的糧食作物，也是一種重要的模式生物，對(duì)相關(guān)基因進(jìn) 行功能研究具有重要作用。隨著全球氣候持續(xù)變暖、上壤持續(xù)惡化，逆境脅迫越來(lái)越成為制 約水稻生長(zhǎng)發(fā)育、影響水稻產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素，如干旱、高溫、高鹽堿、病蟲(chóng)害等。挖掘 與水稻抗逆境和脅迫相關(guān)基因具有一定的理論和實(shí)踐意義。CAT基因在植物的脅迫反應(yīng)中 發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，但其在水稻中的相關(guān)功能及作用機(jī)制還知之甚少，通過(guò)在水稻 體內(nèi)降低其基因的表達(dá)水平為將為其抗逆機(jī)制提供重要的理論依據(jù)和新思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種抑制水稻過(guò)氧化氨酶基因OSCATl的方法，提供了一種 沉默水稻過(guò)氧化氨酶基因OSCATl的SgRNA,及用于沉默水稻OSCATl基因的載體。
[0008] 本發(fā)明的沉默水稻過(guò)氧化氨酶基因OSCATl的SgRNA,其DNA序列如SEQIDN0.1所 /J、-O
[0009] 用于沉默水稻OSCATl基因的載體，其特征在于含有特異性祀向OSCATl基因第二 外顯子的SgRNA的表達(dá)載體和化s9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體，其中SgRNA序列上游為水稻U6 啟動(dòng)子，化s9上游為玉米加強(qiáng)型啟動(dòng)子，篩選標(biāo)記為潮霉素。
[0010] 本發(fā)明的祀向沉默水稻過(guò)氧化氨酶基因OSCATl的載體構(gòu)建方法，按W下步驟進(jìn) 行：
[0011] (1)根據(jù)在線軟件ht1:p://c;risp;r.mit.edu/ 捜尋OSCATl(X0C_0s03g03910)基因 的合適的祀標(biāo)序列，OSCATl的序列特征見(jiàn)SEQNO6所示，祀標(biāo)序列見(jiàn)SEQIDNO. 2所示。 [001引 似將祀標(biāo)序列去除末端NGG獲得SgRNA序列，其DNA序列見(jiàn)SEQIDNO. 1所示；將 SEQIDNO. 1序列反向互補(bǔ)獲得SgRNA的反向互補(bǔ)序列，其DNA序列見(jiàn)SEQIDNO. 3所示。 [001引 做在sGRNA序列的5端引入6個(gè)額外的堿基TGTGTG獲得SEQIDNO. 4序列；在 sGRNA反向互補(bǔ)序列的5端引入4個(gè)額外的堿基AAAC，3端引入2個(gè)額外的堿基CA獲得SEQ IDNO. 5序列。人工合成沈QIDNO. 4和沈QIDNO. 5的序列后并將其制備成Oligo二聚 體；
[0014] (4)將制備好的Oligo二聚體連接至載體BGK03U6啟動(dòng)子上游，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 D冊(cè)a獲得載體BGK03-0SCAT1。
[0015] 3.本發(fā)明的有益效果是干擾載體BGK03-0SCAT1轉(zhuǎn)化水稻后，即可實(shí)現(xiàn)高效、快 速、特異對(duì)水稻OSCATl基因進(jìn)行沉默。轉(zhuǎn)基因水稻植株呈現(xiàn)生長(zhǎng)矮小、不分葉、葉片呈病葉 狀，可直接用此做研究材料來(lái)探討OSCATl基因的功能和作用機(jī)理，為在生產(chǎn)實(shí)踐上更好利 用OSCATl基因進(jìn)行遺傳改良奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] (1)圖1為本發(fā)明的水稻OSCATl基因的目標(biāo)祀位點(diǎn)，通過(guò)在線設(shè)計(jì)篩選第2外顯 子2處為目標(biāo)祀位點(diǎn)。小寫(xiě)字母代表內(nèi)含子，大寫(xiě)字母代表外顯子。
[0017] (2)圖2為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻中OSCATl基因目標(biāo)祀序列的比對(duì)結(jié)果。A為野生 型水稻9522,B-D為轉(zhuǎn)基因水稻，陰影部分為目標(biāo)祀序列。
[001引 （3)圖3為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻中OSCATl基因突標(biāo)祀序列的峰圖。A為野生型水 稻9522,B-D為轉(zhuǎn)基因水稻，框內(nèi)所示序列為目標(biāo)祀序列，其中轉(zhuǎn)基因C的祀序列全部缺失。
[0019] (4)圖4為轉(zhuǎn)基因水稻植株；其中A和D為野生型，B，C和E為轉(zhuǎn)基因水稻。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，運(yùn)些實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明 本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0021] 實(shí)施例中所設(shè)及的試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、各種限制性內(nèi)切酶、化q DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司（大連）產(chǎn)品，質(zhì) 粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，CRISPR-化s9載體BGK03購(gòu)自杭 州百格生物技術(shù)公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；儀器均為分子生物學(xué)W及基因工程實(shí)驗(yàn) 室常用儀器。所有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本發(fā)明實(shí)施例 中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0022] 實(shí)施例1 :水稻OsCATl基因目標(biāo)祀序列的獲得
[0023] 利用tigr在線數(shù)據(jù)庫(kù)查找水稻OsCATl基因L0C_0s03g03910并下載。根據(jù)在線 軟件ht化V/crispr.mit.e化/捜尋5' (N)20NGG-3'序列，并根據(jù)祀向位點(diǎn)，錯(cuò)配堿基數(shù)、錯(cuò) 配位置等進(jìn)行優(yōu)化，最后選擇位于第二外顯子上
[0024] "CTCGTTCAACGGCCCGCTGTGG"作為目標(biāo)祀序列，見(jiàn)圖 1.
[00巧]實(shí)施例2 :水稻BGK03-0SCAT1載體的構(gòu)建
[002引 （1)SgRNA序列：目標(biāo)祀序列去除3端PAM序列TGG得到SgRNA序列 "CTCGTTCAACGGCCCGCTG"
[0027] 似SgRNA反向互補(bǔ)序列：將SgRNA序列反向互補(bǔ)獲得反向互補(bǔ)序列 "CAGCGGGCCGTTGAACGAGC"。
[0028] (3)根據(jù)選擇的載體BGK03的酶切位點(diǎn)，在SgRNA序列的5端引入6個(gè)額外的堿基 TGTGTG獲得SEQIDNO. 4序列；在SgRNA反向互補(bǔ)序列的5端引入4個(gè)額外的堿基AAAC，3 端引入2個(gè)額外的堿基CA獲得SEQIDNO. 5序列。將SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5的序 列交由上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行人工合成分別得到UPOligo和LowOligo。
[0029] (4)Oligo二聚體的制備：
[0030] 將合成的Oligo加水溶解至10yM，按下列反應(yīng)體系混合后，95°C加熱3分鐘，然后 W約0. 2°C/秒緩慢降至20°C，反應(yīng)在博日PCR上進(jìn)行。反應(yīng)體系為：
[0031] BufferAnneal 18ul
[0032] UPOligoIUI
[0033] LowOligoIyl
[0034] (5)將Oligo二聚體構(gòu)建至BGK03載體。
[0035] 按下列反應(yīng)體系在冰上混合各個(gè)組分，混勻后室溫（20°C)反應(yīng)1小時(shí)