。
[0036] E!GK03 2 .Li! OHgo '?始體 1 j.il Enzyme Mix'I.ul H20 Addlo10^1
[0037] (6)轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0038] 將100 y I感受態(tài)腸桿菌E. coli D冊a加入巧）中的連接體系中混勻；混合液冰 浴30min，42°C熱刺激90s后，冰浴5min;加入800y1LB液體培養(yǎng)基，37°C、200巧m搖床培 養(yǎng)45min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常溫3000巧m離屯、Imin收集菌體；在超凈臺上吸去上 清，剩余約0.Iml時，使用移液槍混勻，接入帶有Kan抗性的LB固體平板上，用無菌=角棒 涂布均勻；37°C過夜培養(yǎng)；挑取菌落接種于LB液體+Kan的培養(yǎng)基，37°C、ISOrpm培養(yǎng)12h 后，提取質(zhì)粒。通過PCR檢測獲得的重組質(zhì)粒，并將PCR檢驗正確的重組質(zhì)粒送至生工生物 工程（上海）股份有限公司測序進(jìn)行序列驗證，最后獲得目標(biāo)載體BGK03-0SCAT1。
[0039]實施例 3 :BGK03-0SCAT1 轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105
[0040] (1)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
[0041] 挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于5mlY邸培養(yǎng)基中，28°C搖培過夜，按1:100的 比例接種于50mlY邸培養(yǎng)基中擴(kuò)培，28°C繼續(xù)培養(yǎng)約6-化至0D600 = 0. 4-0. 6。將菌液置 于冰上30min;5000巧m，4°C離屯、5min，棄上清，將菌體懸于IOml0. 15M化Cl中；5000巧m， 4°C離屯、5min，棄上清，菌體用Iml20mMCaCl2,4°C)輕輕懸浮，每管200yl分裝，或加入 終濃度為20%的無菌甘油，-70°C保存。
[0042] 似農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定
[004引將10y1質(zhì)粒DNA加入200y1農(nóng)桿菌感受態(tài)中，混勻，冰浴30min，液氮冷凍 3-5min，37°C水浴5min，加入ImlY邸培養(yǎng)基，28°C搖培3-地。10000巧m，室溫離屯、30s，棄 上清，加入200y1Y邸培養(yǎng)基重懸菌體，涂于Y邸培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)2天；堿裂解法提取 農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒再重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌值冊a)，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落液體培養(yǎng)，提 取質(zhì)粒DN并進(jìn)行PCR鑒定。
[0044]實施例4 :含BGK03-0SCAT1的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化水稻 [004引 （1)材料的預(yù)處理
[0046] 首先將干種子去殼，去殼種子在70%乙醇中浸泡1分鐘，然后在50%漂白劑（含 2%肥10)中滅菌20分鐘，再用無菌水洗4次，將整個種子轉(zhuǎn)移至MD2培養(yǎng)基平板上，26°C 暗培養(yǎng)4天。當(dāng)黃色愈傷組織在胚軸出現(xiàn)時（通常需要四天，在運期間，根通常有2-5cm 長），切除根部和胚乳，將胚軸轉(zhuǎn)移至一個新鮮的NBD2培養(yǎng)基平板，純形面向上，26°C暗培 養(yǎng)7-10天。
[0047] (2)挑取EHA105農(nóng)桿菌單菌落，在100mL含相應(yīng)抗性的Y邸培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)約 16 小時（200巧m，28°C)，至 0D600 為 0. 6-0. 8 左右。
[0048] (3) 3000rmp離屯、10分鐘，在AAM-AS液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中重懸沉淀至濃度 孤600 為 0. 6-0. 8。
[0049] (4)將300個帶有黃色愈傷的胚浸泡在細(xì)菌懸液中20分鐘，間或震蕩。
[0050] 妨從懸液中收集胚，在兩張無菌濾紙間吸干。
[0051] (6)在NBD2-AS培養(yǎng)基平板表面放上無菌濾紙，把胚放在濾紙表面，26°C暗培養(yǎng)2 天。
[0052] (7)把胚的根部去掉，把胚放入新NBD2培養(yǎng)基平板上（含潮霉素和頭抱霉素），切 割面向下，26°C暗培養(yǎng)12天。
[0053](8)再轉(zhuǎn)入新鮮的NBD2培養(yǎng)基平板上（含潮霉素和頭抱霉素），26°C暗培養(yǎng)12-15
[0054] 天，在運個時間可W看見新的愈傷長出。
[00巧](9)把抗性愈傷（將抗性愈傷從胚上切下）放在Pre-MS預(yù)分化培養(yǎng)基平板上， 26°C暗培養(yǎng)8天。
[005引 （10)把愈傷放在生芽培養(yǎng)基MS-H分化培養(yǎng)基平板上，26°C(12小時光照，12小時 黑暗）培養(yǎng)，當(dāng)綠芽出現(xiàn)（大約15天），立即將它們轉(zhuǎn)入新鮮的MS-H培養(yǎng)平板上不要加潮 霉素（如果只看見綠點，立即將它們轉(zhuǎn)入新鮮的MS-H培養(yǎng)基平板上加入終濃度為25mg/L 的潮霉素，防止愈傷形成），新的無根苗在10天內(nèi)
[0057]形成。
[005引（11)將無根苗移入MSNH再生培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)根的形成。
[0059] (12)當(dāng)根形成后，將培養(yǎng)瓶打開7天后，把苗移入溫室。
[0060] 實施例5 :轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和分析
[00川（1)水稻DNA的提取
[0062] 將適量的經(jīng)篩選的水稻葉片放入1.5ml的離屯、管中，加入400yl的CTAB抽 提緩沖液，用藍(lán)色小棒研磨成漿狀，加入等體積酪：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)，猛烈搖勻， 12000rpm，離屯、lOmin。取上清至新的離屯、管中，加入2倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積的 3M醋酸鋼（P冊.2)，劇烈混勻使DNA成團(tuán)，放入-20°C沉淀化rW上。隨后1200化pm，離屯、 lOmin。棄上清，沉淀用70%乙醇洗涂一次后室溫驚干，加適量的TE或超純水溶解。
[0063] (2)轉(zhuǎn)基因水稻植株的鑒定
[0064]W抽提的DNA為模板、使用引物OsCATl-F:AACTGGTAGCAGCAAAGGC和OsCATl-R: TCTTTCTCTTGTGGCCCGC進(jìn)行PCR擴(kuò)增OSCATl片段，PCR的 25y1 體系為：PCR緩沖液 (10*)2.SyUhq0.5yl、cDNA模板 2yl、IOmMdNTP0.5yl、IOyMOSCATl-F'引物 lyl、10yMOSCATl-R'引物lyl、使用無菌水補(bǔ)足25yl。反應(yīng)條件為：94°C5min，35個 循環(huán)，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反應(yīng)lOmin。將PCR產(chǎn)物送至上海生 物工程技術(shù)公司進(jìn)行序列測定并進(jìn)行序列分析，見圖2和3,可W發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)祀 序列出現(xiàn)了錯配。
[0065] (3)轉(zhuǎn)基因水稻植株表型分析
[006引通過尼康D7100數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照，進(jìn)行表型觀察，見圖4。
【主權(quán)項】
1. 一種沉默水稻過氧化氫酶基因0SCAT1的sgRNA，其特征在于：DNA序列如SEQ IDN0. 1 所示。2. 用于沉默水稻0SCAT1基因的載體，其特征在于：含有特異性靶向0SCAT1基因第二 外顯子的sgRNA的表達(dá)載體和Cas9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體，其中sgRNA序列上游為水稻U6 啟動子，Cas9上游為玉米加強(qiáng)型啟動子，篩選標(biāo)記為潮霉素。3. 權(quán)利要求2所述用于沉默水稻0SCAT1基因的載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1) 目標(biāo)革E序列：根據(jù)在線軟件http://crispr.mit.edu/設(shè)計0SCAT1基因的革E標(biāo)序 列，具體的操作步驟為在0SCAT1的全長開放閱讀框，搜索5'-N(20)-NGG-3'類的序列，然后 根據(jù)其綜合評分、脫靶情況，選擇合適的目標(biāo)靶序列，其DNA序列如SEQIDN0. 2所示； (2) sgRNA序列：SEQIDN0. 2序列去除末端TGG的序列，其DNA序列如SEQIDN0. 1所 示； (3) sgRNA反向互補(bǔ)序列：SEQIDN0. 1的方向互補(bǔ)序列，其DNA序列如SEQIDN0. 3所 示； (4) 獲得Oligo二聚體：在sgRNA序列的5端引入6個額外的堿基TGTGTG獲得SEQID N0.4序列；在sgRNA反向互補(bǔ)序列的5端引入4個額外的堿基AAAC，3端引入2個額外的 堿基CA獲得SEQIDNO. 5序列；人工合成SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5的序列并將其制備 成Oligo二聚體； (5) 將制備好的Oligo二聚體構(gòu)建至載體BGK03的U6啟動子上游； (6) 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a獲得目的載體載體BGK03-0SCAT1。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種沉默水稻過氧化氫酶基因OSCAT1的sgRNA，其序列如序列表SEQ？NO.1所示。本發(fā)明首先獲得OSCAT1序列設(shè)計sgRNA識別區(qū)的DNA靶標(biāo)序列，然后設(shè)計OSCAT1的sgRNA表達(dá)序列并構(gòu)建載體。將該載體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻，獲得的陽性轉(zhuǎn)基因苗OsCAT1的靶標(biāo)序列出現(xiàn)錯配。轉(zhuǎn)基因水稻植株呈現(xiàn)生長矮小、不分蘗、葉片呈病葉狀。利用本發(fā)明制備的水稻OSCAT1sgRNA能高效、快速、精確靶向水稻目標(biāo)基因，在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實踐上具有一定的意義。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/113, C12N15/64
【公開號】CN105296487
【申請?zhí)枴緾N201510848054
【發(fā)明人】胡麗芳, 賀浩華, 劉世強(qiáng), 朱昌蘭, 彭小松, 賀曉鵬, 傅軍如, 陳小榮, 歐陽林娟, 邊建民, 孫曉棠, 徐杰, 周大虎
【申請人】江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月27日