黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物領(lǐng)域的遺傳轉(zhuǎn)化方法，特別設(shè)及黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化建立的方法及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑果構(gòu)杞化yciumrutheni州mMurr.)是茄科構(gòu)杞屬的一種帶刺野生灌木，株高 約20~50cm，主要分布于山西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆、西藏等荒漠地區(qū)，呈片狀叢生 分布，對鹽潰化±壤具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。目前對于黑果構(gòu)杞的研究主要集中在果實營養(yǎng) 成分、藥用成分、色素和多糖提取工藝及藥理分析方面，還未見有關(guān)于黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化體 系建立的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的方法。
[0004] 本發(fā)明所提供的黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化建立的方法，包括如下步驟： 陽0化](1)將含有目的DNA的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌得到重組農(nóng)桿菌；將所述重組農(nóng)桿菌在含 有卡那霉素化anamycin，Kan)的LB液體培養(yǎng)基中于28°C振蕩培養(yǎng)24-36小時；
[0006] (2)取所述步驟（1)的菌液于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至 ODeoo值為0. 5-0. 7,離屯、收集菌體； 陽007] (3)用LB液體培養(yǎng)基重懸所述步驟（2)收集的菌體，28°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液 ODe。。值分別為0. 5、0. 6和0. 7,用作侵染液；
[000引 （4)用所述步驟做的侵染液浸泡黑果構(gòu)杞外植體10-30分鐘，得到侵染后的黑果 構(gòu)杞外植體；
[0009] (5)將所述步驟（4)得到的侵染后的黑果構(gòu)杞外植體放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上于黑 暗中共培養(yǎng)2-4天，得到共培養(yǎng)物；
[0010] (6)將所述步驟（5)得到的共培養(yǎng)物用含有500mg/L頭抱霉素（Cefotaxime,Cef) 的無菌水清洗后轉(zhuǎn)移至含有20mg/L卡那霉素和300mg/L頭抱霉素的愈傷組織誘導(dǎo)及篩選 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-14天，得到去除農(nóng)桿菌后的愈傷組織；
[0011] (7)將所述步驟（6)得到的去除農(nóng)桿菌后的愈傷組織在頭抱霉素濃度遞減的愈傷 組織誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周，得到抗性愈傷組織；
[0012] (8)將所述步驟（7)得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入選擇和分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)6-8周，得 到叢生牙；
[0013] (9)將所述步驟（8)得到的叢生芽在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，即得到黑果構(gòu) 杞的抗性再生苗。
[0014] 所述步驟（1)中含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中各成分的濃度為：卡那霉素 5〇111邑/1、膜蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L和氯化鋼lOg/L。
[0015] 所述步驟（2)中含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中各成分的濃度為：卡那霉素 5〇111邑/1、膜蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L和氯化鋼lOg/L。
[0016] 所述步驟（3)中所述菌液的ODe。。值為0. 6。
[0017] 所述步驟（4)中，所述黑果構(gòu)杞外植體為黑果構(gòu)杞葉片；所述浸泡時間為20分鐘。
[0018] 所述步驟（5)中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L薦糖、6.Og/L瓊 脂粉和 0. 2mg/L2, 4-D。
[0019] 所述步驟化）中所述愈傷組織誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L 薦糖、6.Og/L瓊脂粉、0. 2mg/L2, 4-D、20mg/L卡那霉素和300mg/L頭抱霉素。
[0020] 所述步驟（8)中所述選擇和分化培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L薦糖、 6.Og/L瓊脂粉、2.Omg/L6-BA、20mg/L卡那霉素和150mg/L頭抱霉素。
[0021] 所述步驟巧）中所述生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L薦糖、6.Og/L 瓊脂粉和0. 2mg/La-糞乙酸。
[0022] 所述建立黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法在獲得黑果構(gòu)杞轉(zhuǎn)基因材料中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] 本發(fā)明所提供的黑果構(gòu)杞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，操作簡單易行，轉(zhuǎn)化后得到的愈傷組 織存活率高，可為黑果構(gòu)杞的基因工程研究和分子育種提供材料。
【附圖說明】 W24] 圖1為質(zhì)粒提取檢測結(jié)果；泳道1-4 :質(zhì)粒祀T2化；泳道M: 10化PplusDNA IadderD 陽02引 圖2為N址G基因高保真PCR結(jié)果；泳道1和2 :N址G條帶；泳道M:IOObp DNA ladder。
[0026] 圖3為目的基因和載體雙酶切；泳道1 :N址G基因雙酶切；泳道2 :載體地1121雙 酶切；泳道M=IOObpDNA ladder。
[0027] 圖4為利用M13F/R引物進(jìn)行Transl-Tl菌液PCR的結(jié)果；泳道1和2:NahG條帶； 泳道M:DLlOOODNAladder。 陽02引 圖5為攜帶有N址G的GV3101菌液PCR檢測結(jié)果；泳道1和2:N址G條帶；泳道 M:IOObpplusDNAladder。
[0029] 圖6為真核表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
[0030] 圖7為黑果構(gòu)杞葉片Kan耐性試驗；其中，圖7中a:A:對照，B:50mg/LKan， C:100mg/LKan，D:200mg/LKan;圖 7 中b:A:10mg/LKan，B:20mg/LKan，C:對照，D:30mg/ LKan，E:50mg/LKan。
[0031] 圖8為黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗性再生苗的過程;A:外植體侵染后產(chǎn)生的愈傷組 織，B:愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上分化，C:分化的抗性叢生芽，D:生根的抗性再生植株。
【具體實施方式】
[0032] 實施例1、建立黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化體系
[0033] 一、真核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0034] 1、目的基因N址G的獲得 陽0對 （1)質(zhì)粒提取
[0036] 含有載體陽T2化-N址G的E.coli菌株D冊a由中國人民武裝警察部隊 后勤學(xué)院（天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室）趙化冰老師惠贈。NahG基因 (AY20891ND09189257-90561)來自糞降解菌株P(guān)seudomonasSP.ND6 狂haoetal. 2005)。將 D冊a(pET21b-N址G)接種至LB液體培養(yǎng)基，37°C，200巧m/min振蕩培養(yǎng)過夜，使用天根質(zhì) 粒小提試劑盒（TIANprepMiniPlasmidKit)提取質(zhì)粒，方法如下：
[0037] 1.向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500yL的平衡液化，12, 00化pm 離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，平衡吸附柱；
[0038] 2.取l-5mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離屯、管中，使用常規(guī)臺式離屯、機(jī)，12, 00化pm離 屯、Imin,盡量吸除上清；
[0039] 3.向留有菌體沉淀的離屯、管中加入250yL溶液Pl(使用前加入RNaseA)，滿旋 振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀；
[0040] 4.向離屯、管中加入250yL溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解；
[0041] 5.向離屯、管中加入350yL溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時 將出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12, 00化pm離屯、IOmin;
[0042] 6.將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管 中），12,O(K)巧m離屯、30-60S，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中；
[0043] 7.向吸附柱CP3中加入600yL漂洗液PW(使用前加入無水乙醇），12, 00化pm離 屯、30-60S，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中； W44] 8.重復(fù)操作步驟7 ; 陽045] 9.將吸附柱CP3放入收集管中，12, 00化pm離屯、2min，將吸附柱中殘余的漂洗液 去除。將吸附柱CP3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，W徹底驚干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0046] 10.將吸附柱CP3置于一個干凈的離屯、管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100yL 洗脫緩沖液邸，室溫放置2min，12, 00化pm離屯、2min，將質(zhì)粒溶液收集到離屯、管中。
[0047] 將提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1。 W48] 0)引物設(shè)計、合成及PCR法擴(kuò)增目的基因N址G
[0049] 用PrimerPremie巧軟件設(shè)計引物，并添加與表達(dá)載體相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切 位點，由生工（SangonBiotec)合成，最終引物序列如下： 陽0加]NG-F5, -CGCGGATCCATGAAAAACAATAAACC-3'
[0051]NG-R5, -CCAATCTCGAGCCCTTGACGTAGCAC-3，
[0052] 其中下劃線部分為BamHI酶切位點，斜體部分為化Ol酶切位點。W提取的質(zhì)粒載 體祀T2化為模板，用高保真DNA聚合酶Pyrobest進(jìn)行PCR，獲取目的基因N址G，50yL反應(yīng) 體系如下：
[0053]
[0056] PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2。
[0057] 用化ansgen DNA膠回收試劑盒回收目的基因片段，方法如下： 陽化引1.紫外燈下切取含DNA片段的瓊脂糖凝膠，放入1. 5血離屯、管內(nèi)；
[0059] 2.加入3倍凝膠體積的溶膠液GSB，55°C水浴直至凝膠完全溶化； W60] 3.溶膠冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到DNA吸附管離屯、柱中，靜置Imin;
[0061] 4. 12, 000巧m，離屯、30 - 60s;棄流出液； 陽06引5.加入650yL漂洗液WB，12, 000巧m，離屯、30 - 60s，棄流出液；
[0063] 6.000巧m，空離屯、2min，去除殘留WB; W64] 7.將吸附柱開蓋于超凈工作臺2min，使WB完全揮發(fā)； W65] 8.加入30-50yL洗脫液TE,室溫靜置Imin;吸附柱放入新的1. 5血離屯、管；
[0066] 9. 12, 000巧m，離屯、2min，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0067] (3)PCR產(chǎn)物序列測定 W側(cè)測定了 3個陽性單克隆，其序列完全一致，與已發(fā)表的N址G序列有2個堿基的差 異，即43位和609位（identity= 99. 58% )，可W認(rèn)為擴(kuò)增得到的基因即為N址G。
[0069] (4)目的基因與表達(dá)載體酶切、回收與連接
[0070] 將地1121質(zhì)粒與N址G(連接至祀ASY-T3載體）分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和 化Ol進(jìn)行雙酶切，20yL酶切體系：
[0071] 加H?0 10.8 |j.L IOxBuITcrD 2.0 uL. BSA (K)Mg-Vl) 0.2 mL DNA 6.0 uL 公"";H! (10U.VL) 0.5 !_止 A7wl(iOU4iU 0.5 |.iL 37°C反應(yīng) 4h。
[0072] 雙酶切結(jié)果見圖3。
[0073] 瓊脂糖凝膠電泳分離并切取所需DM片段，用DM膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，方法同 上。將回收片段用TaDNA連接酶連接，10yL連接體系：
[0074] T.4 10<Bu(Tor 1jiL NahG片段 5呼 pBU21大片段 3jxL 74IJgasc(350U/pL)IjiL 16 "C反應(yīng)過夜。
[0075] 3、連接產(chǎn)物擴(kuò)增及序列測定
[0076] 利用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至50JiL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transl-Tl,涂布卡那 霉素抗性選擇培養(yǎng)基平板（LB固體培養(yǎng)基巧Omg/LKan)。挑取陽性單菌落，接種至LB液體 培養(yǎng)基，37°C，200rpm/min振蕩培養(yǎng)14h，提取質(zhì)粒并測序。
[0077] 菌液PCR法鑒定陽性克隆，15 y L體系如下：
[0078] 2XPCRMix 7 5|_iL .VG--F(IO^M) 化 6[iL (IOliM) 0.6LiL 菌液 I.OiaL 加H2O 5.3