叫
[0079] PCR擴(kuò)增程序：
[0080]
[0081] 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4。
[0082] 4、熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞
[0083] 采用熱激法將目的基因與表達(dá)載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株（購(gòu)自北 京華越洋生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)Waryong GT707)，方法如下：
[0084] 1)將連接產(chǎn)物加入50 y L感受態(tài)細(xì)胞，輕柔混勻，冰浴30min ; 陽(yáng)0化]2)液氮中速凍Imin, 37°C水浴3min，加入500 y L液體LB培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)4h ;
[0086] 3)取500 y L菌液涂布于卡那霉素抗性篩選培養(yǎng)基平板上，吹干，28°C倒置培養(yǎng) 2-3天；
[0087] 4)利用PCR法鑒定陽(yáng)性克隆。
[0088] 菌液PCR方法同上，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序，所測(cè)序列與原 序列一致。至此，完成真核表達(dá)載體的構(gòu)建和攜帶目的基因的農(nóng)桿菌（工程菌）構(gòu)建，真核 表達(dá)載體示意圖見圖6。
[0089] 二、黑果構(gòu)杞的遺傳轉(zhuǎn)化
[0090] 1、黑果構(gòu)杞對(duì)卡那霉素的耐性試驗(yàn)
[0091] 將黑果構(gòu)杞幼苗葉片接種至含有不同濃度卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，觀察葉片對(duì) 卡那霉素的耐受性。分別設(shè)置卡那霉素的濃度為：〇, 50, 100, 150, 200, 250和300mg/l，結(jié) 果：當(dāng)卡那霉素濃度大于200mg/L時(shí)，外植體在接種3天后即出現(xiàn)白化現(xiàn)象，5天后幾乎全 部白化死亡；當(dāng)卡那霉素濃度為50mg/L時(shí)，外植體與對(duì)照沒有明顯差別；當(dāng)卡那霉素濃度 為100和150mg/L時(shí)，外植體在接種兩周后明顯變黃，S周后半數(shù)外植體白化死亡。結(jié)果見 圖7曰。
[0092] 之后，進(jìn)一步實(shí)施了黑果構(gòu)杞外植體在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+30g/L薦糖 +6.0g/L瓊脂粉+0.2mg/L2,4-D)上的卡那霉素耐性試驗(yàn)，將外植體接種在卡那霉素濃度 依次為0,10, 20, 30, 50mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，卡那霉素濃度為0的對(duì) 照組外植體接種10天后開始形成愈傷組織；卡那霉素濃度為10和20mg/L的外植體在接 種15天時(shí)開始出現(xiàn)愈傷組織，且前者愈傷組織形成率高于后者；卡那霉素濃度高于30mg/L 后，外植體變干，愈傷組織形成減少，質(zhì)量差，且形成時(shí)間嚴(yán)重推后。因此本實(shí)驗(yàn)選擇20mg/ L卡那霉素作為篩選壓力，結(jié)果見圖化。
[0093] 2、侵染試驗(yàn)
[0094] 1)將PCR檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證為陽(yáng)性的單克隆接種于含50mg/L卡那霉素的LB液 體培養(yǎng)基（膜蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L、氯化鋼10g/L;pH7.0)中，28°C振蕩培養(yǎng) 24-3 化；
[0095] 2)取1血上述菌液于50血含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基（膜蛋白腺IOg/ L酵母提取物5g/L、氯化鋼lOg/L;pH7. 0)中，28°C振蕩培養(yǎng)至ODe。。值為0. 5-0. 7,然后 4, 000巧m，4°C離屯、IOmin,收集菌體；
[0096] 3)用LB液體培養(yǎng)基（膜蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L、氯化鋼lOg/L;抑7. 0) 重懸菌體，28°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至ODe。。值分別為0. 5、0. 6和0. 7,用作侵染液；
[0097] 4)取苗齡20-25天的黑果構(gòu)杞葉片和莖段作為外植體，用上述侵染液浸泡外植體 不同時(shí)間：10、20和30min ;同時(shí)用前期培養(yǎng)的黑果構(gòu)杞愈傷組織進(jìn)行同樣的侵染實(shí)驗(yàn)；
[0098] 5)用無(wú)菌吸水紙將侵染后的葉片上多余的菌液吸干，然后將葉片放置于共培養(yǎng)培 養(yǎng)基MSi(MS+30g/L薦糖+6.0g/L瓊脂粉+0. 2mg/L 2,4-D)上于黑暗中共培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間；侵 染試驗(yàn)W不同外植體類型、菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，W獲 得最佳侵染方案（見表1)。
[0099] 表1.黑果構(gòu)杞侵染試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)
陽(yáng)1〇U 注：GO表示轉(zhuǎn)化空載體地1121 ;GV表示轉(zhuǎn)化重組載體地1121-N址G
[0102] 6)共培養(yǎng)結(jié)束后用含有500mg/L頭抱霉素的無(wú)菌水清洗后，將葉片轉(zhuǎn)移至愈傷組 織誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基MSz(MS+30g/L薦糖+6. Og/L瓊脂粉+0. 2mg/L 2, 4-D巧Omg/L卡那霉 素+300mg/L頭抱霉素），培養(yǎng)10-14天，得到去除農(nóng)桿菌后的愈傷組織； 陽(yáng)10引 7)兩周后更換培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基中頭抱霉素濃度降至200mg/l，W后每10天更換 一次培養(yǎng)基，頭抱霉素濃度依次遞減；
[0104] 8) -個(gè)月后將誘導(dǎo)出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入選擇和分化培養(yǎng)基MSs(MS+30g/L薦糖 +6.Og/L瓊脂粉巧.Omg/L6-BA+20mg/L卡那霉素+150mg/L頭抱霉素）上繼續(xù)培養(yǎng)，每20 天更換一次培養(yǎng)基； 陽(yáng)1化]9)兩個(gè)月后叢生芽在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSa(MS+30g/L薦糖+6. Og/L瓊脂粉+0. 2mg/ L NAA)上誘導(dǎo)生根，即得到黑果構(gòu)杞的抗性再生苗。 陽(yáng)106] 10)抗性苗PCR鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗
[0107] W黑果構(gòu)杞抗性再生苗基因組DM為模板，用地1121載體的Kan抗性基因 (噸tII)引物進(jìn)行PCR，W檢測(cè)地1121表達(dá)載體是否整合入植株基因組；同時(shí)W載體上的 35S啟動(dòng)子上游引物/NahG基因下游引物（35SF/NGR)進(jìn)行PCR，檢測(cè)目的基因NahG是否整 合入植株基因組。 陽(yáng)108] Kan抗性基因（噸tII)引物序列：
[0109] Kan-F: 5' -TATGACTGGGCACAACAGACAA
[0110] Kan-R: 5' -AGCGGCGATACCGTAAAGCAC 陽(yáng)111]目的基因檢測(cè)引物序列：
[0112] 35SF: 5 '-ACCCACAGATGGTTAGAGAGG
[0113] NGR: 5'-CCAATCTCGAGCCCTTGACGTAGCAC
[0114] PCR體系和程序與上文連接產(chǎn)物擴(kuò)增與序列測(cè)定的體系和程序相同。
[0115] W上兩個(gè)PCR反應(yīng)結(jié)果表明，NahG基因整合入黑果構(gòu)杞基因組，得到的抗性再生 苗為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗。
[0116] 遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗性再生苗的過(guò)程如圖8所示。
[0117] 3.黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化體系方法的確定
[0118] 由侵染實(shí)驗(yàn)（表1)的結(jié)果可知，對(duì)于黑果構(gòu)杞的遺傳轉(zhuǎn)化，用葉片作為外植體進(jìn) 行侵染其效果優(yōu)于莖段，而用愈傷組織直接侵染效果最差，究其原因可能是侵染后的愈傷 組織吸附菌體過(guò)多，且不易去除，使得共培養(yǎng)時(shí)愈傷組織被菌體污染致死。菌液濃度0. 5、侵 染時(shí)間30min、共培養(yǎng)4天的實(shí)驗(yàn)組合與菌液濃度0. 6、侵染時(shí)間20min、共培養(yǎng)2天的實(shí)驗(yàn) 組合相比，二者轉(zhuǎn)化效率沒有顯著差異。因此，綜合考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性及時(shí)間因素，我們 確立了黑果構(gòu)杞遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)選方法，即：W葉片為外植體，侵染菌液ODe。。為0. 6,菌 液浸泡時(shí)間為20min，菌體與外植體共培養(yǎng)時(shí)間為2天；各時(shí)期所用培養(yǎng)基類型及成分分別 為：
[0119] 共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSi=MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L薦糖、6.0g/L瓊脂粉和0. 2mg/L 2,4-D。
[0120] 愈傷組織誘導(dǎo)及選擇培養(yǎng)基MS2:MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L薦糖、6. Og/L瓊脂粉、 0. 2mg/L2, 4-D、20mg/L卡那霉素和300mg/L頭抱霉素。 陽(yáng)12U 選擇和分化培養(yǎng)基MSs=MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L薦糖、6.Og/L瓊脂粉、2.Omg/L 6-BA、20mg/L卡那霉素和150mg/L頭抱霉素。
[0122] 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4:MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L薦糖、6.Og/L瓊脂粉和0. 2mg/ La-糞乙酸。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種建立黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，包括如下步驟： (1) 將含有目的DNA的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌得到重組農(nóng)桿菌；將所述重組農(nóng)桿菌在含有卡 那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于28°C振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)； (2) 取所述步驟（1)的菌液于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至 0D600值為0. 5-0. 7,離心收集菌體； (3) 用LB液體培養(yǎng)基重懸所述步驟（2)收集的菌體，28°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液0D600 值分別為〇. 5、0. 6和0. 7,用作侵染液； (4) 用所述步驟（3)的侵染液浸泡黑果枸杞外植體10-30分鐘，得到侵染后的黑果枸杞 外植體； (5) 將所述步驟（4)得到的侵染后的黑果枸杞外植體放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上于黑暗中 共培養(yǎng)2-4天，得到共培養(yǎng)物； (6) 將所述步驟（5)得到的共培養(yǎng)物用含有500mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水清洗后轉(zhuǎn)移至 含有20mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢霉素的愈傷組織誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-14天， 得到去除農(nóng)桿菌后的愈傷組織； (7) 將所述步驟（6)得到的去除農(nóng)桿菌后的愈傷組織在頭孢霉素濃度遞減的愈傷組織 誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周，得到抗性愈傷組織； (8) 將所述步驟（7)得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入選擇和分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)6-8周，得到叢 生芽； (9) 將所述步驟（8)得到的叢生芽在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，即得到黑果枸杞的 抗性再生苗。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1)中含有卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基中各成分的濃度為：卡那霉素50mg/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化鈉 10g/L〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟⑵中含有卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中各成分的濃度為：卡那霉素50mg/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化 鈉 l〇g/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步驟（3)中所述菌液的 0D600 值為 0. 6。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步驟⑷中，所述黑果枸杞 外植體為黑果枸杞葉片；所述浸泡時(shí)間為20分鐘。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中所述的方法，其特征在于：所述步驟（5)中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基 為：MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L蔗糖、6. 0g/L瓊脂粉和0. 2mg/L 2, 4-D。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述步驟（6)中所述愈傷組織 誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L蔗糖、6. 0g/L瓊脂粉、0. 2mg/L 2, 4-D、 20mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢霉素。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述步驟（8)中所述選擇和分 化培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基，附加30g/L蔗糖、6. 0g/L瓊脂粉、2. 0mg/L 6-BA、20mg/L卡那 霉素和150mg/L頭孢霉素。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述步驟（9)中所述生根誘導(dǎo)
【專利摘要】本發(fā)明公開了黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的方法，包括如下步驟：(1)將含有目的DNA的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌得到重組農(nóng)桿菌；(2)培養(yǎng)重組農(nóng)桿菌用作轉(zhuǎn)化侵染液；(3)用侵染液浸泡黑果枸杞外植體；(4)將外植體放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基共培養(yǎng)；(5)將共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并去除農(nóng)桿菌；(6)以卡那霉素作為篩選壓力，誘導(dǎo)抗性愈傷組織；(7)將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到叢生芽；(8)誘導(dǎo)生根，即得到黑果枸杞抗性再生苗，抗性苗經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗。本發(fā)明所提供的黑果枸杞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，操作簡(jiǎn)單易行，愈傷組織存活率高。
【IPC分類】C12N15/84, A01H5/00
【公開號(hào)】CN105296534
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510017117
【發(fā)明人】任紅旭, 胡慧霞, 舒慶艷
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院植物研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月13日