重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中基因工程和蛋白工程，具體地說(shuō)就是一種桿狀病毒的 重組構(gòu)建方法，可用于表達(dá)重組蛋白、構(gòu)建基因治療載體、制備偽病毒樣顆粒疫苗等。
【背景技術(shù)】
[0002] 桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)度EV巧是一種利用昆蟲桿狀病毒作為載體，在蟲體內(nèi)或 者宿主昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。因其極晚期基因（地和PlO)啟動(dòng)子可 W強(qiáng)效驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)而常用于構(gòu)建重組病毒，高效表達(dá)目的蛋白。自從1983年，Smith 等人利用AcMNPV作為表達(dá)載體高水平地表達(dá)了人0 -干擾素后，在近S十年間，BEVS表達(dá) 了成千上萬(wàn)的外源蛋白，因而成為繼大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的=大表達(dá)系統(tǒng)之后 又一個(gè)重要的表達(dá)系統(tǒng)。
[0003] 最早的BEVS是通過(guò)與野生病毒同源重組來(lái)實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)的，重組效率極 低，不到0. 1%，而且需要多輪隧斑篩選純化病毒，技術(shù)復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力。后來(lái)，Kitts等人 將IacZ基因插入到多角體基因座位置，并在orfl629和orf603基因處各引入一個(gè)BSU36I 酶切位點(diǎn)構(gòu)建了一種可W通過(guò)線性化獲得復(fù)制缺陷型病毒的方法度acPAK系統(tǒng)），病毒DNA 被BSU36I線性化之后，由于缺失了復(fù)制所必需的基因orfl629,即使自連也無(wú)法產(chǎn)生有感 染力的病毒。線性化的該載體系統(tǒng)與轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染，同源重組獲得重組病毒。但由于無(wú) 法保證病毒載體100%線性化，因此，仍然需要進(jìn)行隧斑篩選W純化病毒。隨后Lee等在桿 狀病毒DNA上引入細(xì)菌人工染色體片段度AC),建立了Bac-to-Bac的邸VS。該系統(tǒng)引入的 BAC片段具有細(xì)菌mini-F復(fù)制子、Tn7轉(zhuǎn)座位點(diǎn)、卡那霉素化an)抗性基因，使病毒DNA能 夠W質(zhì)粒的形式在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，通過(guò)轉(zhuǎn)座重組克隆目的基因，藍(lán)白篩選獲得單克隆重 組DNA，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后復(fù)制擴(kuò)增產(chǎn)生重組病毒并表達(dá)外源蛋白。
[0004]Zhao和化ssee等分別建立了 一套復(fù)制缺陷型的病毒載體BAClO:K01629和 flashBAC。他們?cè)诨蚪M中插入一個(gè)低拷貝的mini-F復(fù)制子失活orfl629。運(yùn)種方法結(jié) 合了BacPAK系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，只需要構(gòu)建一個(gè)重組轉(zhuǎn)移載體，并與BAClO: K01629或fIashBAC載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞就可W-步法獲得重組病毒，無(wú)需篩選。
[0005] 此外，也出現(xiàn)如酵母-昆蟲細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體系統(tǒng)和化e-loxP系統(tǒng)等桿狀病毒重 組方法。國(guó)內(nèi)，也出現(xiàn)一些新的重組病毒構(gòu)建方法。但總的來(lái)說(shuō)，運(yùn)些方法，要么仍然需要 隧斑篩選，要么需要特定菌株重組克隆，要么借助特別重組酶和標(biāo)記基因，桿狀病毒重組方 法并沒(méi)有新的突破。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的一種重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法，包括 兩個(gè)主要構(gòu)成元件：可線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體和重組捶救DNA片段，上述兩個(gè) 元件在昆蟲細(xì)胞內(nèi)直接重組（自行直接重組）產(chǎn)生重組桿狀病毒。
[0008] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法的改進(jìn)：所述線性化的復(fù)制缺陷型桿 狀病毒載體和重組捶救DNA片段在昆蟲細(xì)胞內(nèi)的DNA重組設(shè)及到IO-SObp長(zhǎng)同源臂的同源 重組和/或非同源的末端連接。
[0009] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0010] 所述可線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體為在病毒基因組中W細(xì)菌人工染色體 片段（即包含miniF復(fù)制子的BAC片段）替代桿狀病毒多角體基因座及復(fù)制必需基因 O計(jì)1629的3'端序列，并在BAC片段與orfl629之間引入一個(gè)單酶切位點(diǎn)BSU36I;
[0011] 所述重組捶救DNA片段為一端包含orfl629缺失的3'端序列及其同源臂序列，另 一端包含或不包含BAC片段的同源臂。
[0012] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：可線性化的復(fù)制缺陷 型桿狀病毒載體，在與重組捶救DNA片段共轉(zhuǎn)染時(shí)利用BSU36I酶切成線性的包含0rfl629 末端和BAC末端的單個(gè)片段。
[0013] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：重組捶救DNA片段， 其一端包含的〇rfl629同源臂序列至少IObp長(zhǎng)。
[0014] 備注說(shuō)明：
[0015] 通常，同源重組中同源臂越長(zhǎng)重組的概率越高。本發(fā)明已證實(shí)包含10到50bp同 源臂的重組捶救DNA片段均能與線性化病毒載體重組產(chǎn)生重組病毒，無(wú)同源臂的片段無(wú)法 產(chǎn)生重組病毒。
[0016] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述重組捶救DNA片 段，可W是化學(xué)合成的，也可W是通過(guò)其他方法合成的包含除必需基因捶救DNA序列及同 源臂W外的其他序列DNA。
[0017] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0018] 無(wú)縫克隆方法為：是通過(guò)重組捶救DNA片段與線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體 混合，然后一起導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)同源重組和/或非同源的末端連接產(chǎn)生重組病毒。
[0019] 本發(fā)明的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆的方法的技術(shù)方案具體如下：
[0020] -種可線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體，運(yùn)種桿狀病毒載體在病毒基因組多角 體基因座插入細(xì)菌人工染色體片段度AC,包含miniF復(fù)制子、Tn7轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)和卡那霉素抗 性基因），并缺失復(fù)制必需基因OTf1629的3'端序列，化及在BAC片段與OTf1629之間引入 一個(gè)單酶切位點(diǎn)BSU36I。
[0021] 上述可線性化復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體克隆過(guò)程包含如下步驟：
[0022] 1)在桿狀病毒穿梭載體度mBacmid，見(jiàn)專利ZL201210037290. 8,或者Bacmid bM0N14271)基礎(chǔ)上，W氯霉素（Cm)抗性基因表達(dá)盒（CAT)作為打祀片段，通過(guò)Red重組，在 大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)敲除桿狀病毒復(fù)制必需基因〇rfl629的3'端序列，同時(shí)在CAT兩側(cè)各引入 一個(gè)BSU36I位點(diǎn)，產(chǎn)生復(fù)制缺陷型的桿狀病毒穿梭載體BmBacmid-CAT-K01629。
[0023] 2)然后Bsu36I酶切去除CAT,通過(guò)T4DNA連接酶連接Bsu36I粘性末端，使酶切后 的分子自連，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化DHlOB大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)卡那霉素化an)抗性和氯 霉素（Cm)敏感性篩選獲得消除CAT的重組Bacmid,即可線性化復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體 BmBacmid-K01629〇
[0024] 本發(fā)明所述重組捶救DNA片段為一端包含orfl629缺失的3>端序列及其同源臂 序列，另一端包含或不包含BAC片段的同源臂，該重組捶救DM片段由由必需基因捶救DM片段、目的基因片段和啟動(dòng)子片段通過(guò)重疊PCR的方法合成，具體包含W下步驟：
[00巧]1)必需基因捶救DNA片段，為包含必需基因OTf1629缺失序列和同源臂的片段。[002引。目的基因片段，W目的基因DNA為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增合成，合成的目的基 因片段兩端分別與必需基因捶救DNA片段和啟動(dòng)子片段有20-5化P的重疊。
[0027] 3)啟動(dòng)子片段，根據(jù)目的基因定位的宿主W化學(xué)方法或PCR法合成相應(yīng)的啟動(dòng)子 序列。
[0028] 4)上述S個(gè)DNA片段，按照重疊PCR的方法合成包含目的基因表達(dá)盒和必需基因 O計(jì)1629缺失序列的重組捶救DNA片段。
[0029] 本發(fā)明公開的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆方法，其DNA重組過(guò)程是，可線性化復(fù)制缺 陷型桿狀病毒載體BmBacmid-K01629經(jīng)BSU36I酶切而線性化，然后與重疊PCR合成的重組 捶救DNA片段混合，再共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞BmN。在BmN細(xì)胞內(nèi)，重組捶救DNA片段通過(guò)一端的 O計(jì)1629同源臂與線性化的BmBacmid-K01629發(fā)生同源重組，修復(fù)必需基因orfl629而救活 病毒，另一端則或末端連接，或同源重組。
[0030] 本發(fā)明所提及的重組方案，所用昆蟲桿狀病毒及其培養(yǎng)細(xì)胞，可線性化的復(fù)制缺 陷型桿狀病毒載體元件中所選擇缺失的必需基因，及重組捶救DNA片段所包含同源臂和目 的DNA的改變，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031] 本發(fā)明公開的重組桿狀病毒無(wú)縫克隆方法，無(wú)需構(gòu)建目的基因的轉(zhuǎn)移載體和隧斑 篩選，也無(wú)需特定菌株或重組酶的作用，操作簡(jiǎn)單高效，可高通量構(gòu)建重組桿狀病毒，