組或末端連接。
[0095] 實施例6、無縫克隆快速構(gòu)建重組桿狀病毒表達目的基因
[0096] 根據(jù)實施例3重組捶救DNA片段的合成和實施例4重組桿狀病毒無縫克隆 的操作，設(shè)計如下引物，分別WPFas巧a地TB-DsRed、四方家蠶核型多角體病毒基因組、 pSV-P-Galactosidase和pGL4. 10 [luc2]為模板PCR擴增，通過KOD-Plus-NeoDNA聚合酶 擴增紅色巧光蛋白基因RFP、多角體蛋白基因化、0 -半乳糖巧酶基因LacZ和巧光素酶基 因Luc2。
[0097]
[0098] 備注說明：該PCR擴增的體系和程序，參照上述實施例3中AcGFP基因的擴增，并 根據(jù)目的基因長度和KOD-Plus-Neo DNA聚合酶的延伸速度適當修改擴增反應(yīng)的延伸時間。
[0099]PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后，與多角體基因啟動子片段巧h、包含50bp同源臂的必 需基因捶救DNA片段orfl6293' -HA50通過重疊PCR法合成4種重組捶救DNA片段： 巧h-RFP-HA50、P地-Ph-HA50、巧h-LacZ-HA50 和巧h-Luc2-HA50,結(jié)果如圖 9 所示。
[0100] 包括巧h-GFP-HA50在內(nèi)的5種重組捶救DNA片段分別與BSU36I線性化的 BmBacmid-K01629各50ng共轉(zhuǎn)染BmN細胞，轉(zhuǎn)染后9化可W觀察到細胞全部發(fā)病。其中， P地-GFP-HA50和巧h-RFP-HA50與線性化的BmBacmid-K01629共轉(zhuǎn)染的細胞分別可W看到 綠色和紅色巧光，P地-Ph-HASO的可W看到細胞中有多角體顆粒的存在。巧h-LacZ-HA50與 線性化的BmBacmid-K01629共轉(zhuǎn)染的細胞上清加入X-gal(50yg/mL)后呈現(xiàn)藍色。具體結(jié) 果如圖10和圖11。
[0101] 為進一步確定5種外源基因在BmN細胞中的表達，進行SDS-PAGE和Western Blotting分析。W本實施例產(chǎn)生的共5種重組桿狀病毒分別接種感染75mLT形瓶培養(yǎng)的 單層BmN細胞（約3XIO6個細胞），同時WBmNPV度mBacmid轉(zhuǎn)染BmN細胞產(chǎn)生的重組病 毒）病毒感染BmN細胞作為陰性對照，7化后收集感染的BmN細胞，用ImL的PBS溶液洗涂 2次，加入150yL的PBS溶液重懸，然后加入等體積的2XLoadingBuffer,混勻，100°C加 熱lOmin，待冷卻后作為蛋白樣品使用。蛋白樣品按20yL/孔加入12%PACiE膠樣品孔，并 加入化rmentas公司蛋白Marker作為分子量參照標準，180V進行恒壓電泳，電泳結(jié)束后考 馬斯亮藍R250染色和脫色。
[0102]SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖12所示，與陰性對照相比，2號泳道的AcGFP在30kD處有 明顯的差異性條帶，與預(yù)期的蛋白分子大小一致；3號泳道的RFP在31kD處有明顯的差異 性條帶，與RFP的預(yù)期分子量要略大5kD;4號泳道的LacZ在116kD處有明顯的差異性條 帶，與預(yù)期的111. 6kD基本相符；5號泳道的Luc2在60kD處有明顯的差異性條帶，與預(yù)期的 59. 4kD基本相符；6號泳道的化在30kD處有明顯的差異性條帶，與預(yù)期的27kD略大3kD。
[0103] 重組病毒產(chǎn)生的五種蛋白除多角體蛋白化缺抗體外，其它的四種蛋白均可W通 過相應(yīng)的抗體作Westernblot檢測，結(jié)果如圖13所示。在SDS-PAGE電泳后，W常規(guī)濕轉(zhuǎn)法 將PAGE凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF上，然后按照Westernblotting操作步驟，依次膜封閉、一 抗解育、二抗解育，最后利用DAB顯色，或者通過E化化學發(fā)光顯影。AcGFP利用Roche公司 Anti-GFP單抗（Cat.No. 11814460001，使用時1:2000稀釋）檢測到在30kD處有明顯的特 異性條帶，與PAGE膠上的差異條帶相符；RFP利用Invitrogen公司抗RFP兔多抗巧10367， 使用時1:3000稀釋）在26和31kD處檢測兩條的特異性條帶，其中31kD條帶與PACiE膠 上的差異蛋白帶相符，表明BmN細胞表達RFP可能存在不同程度的糖基化修飾；Luc2利用 Promega公司兔抗蛋光素酶多抗（G7451，使用時1:3000稀釋）在60kD處檢測到明顯的特 異性條帶，與PAGE膠上的差異蛋白帶相符；LacZ使用Promega公司抗0 -半乳糖巧酶單抗 狂3781，使用時1:5000稀釋）在120kD處檢測到明顯的特異性條帶，與PAGE膠上的差異 蛋白帶基本相符。運些結(jié)果表明，無縫克隆的重組病毒在家蠶細胞中成功表達了GFP、RFP、 LacZ、Luc2和化五種外源蛋白。運些病毒克隆的基因從700bp到4000bp，表達的蛋白大小 從 26kD-120kD不等。
[0104] 所有實施例表明，本發(fā)明公開的重組桿狀病毒無縫克隆方法不僅適用于單個基因 重組桿狀病毒的構(gòu)建，而且可W(批量化）同步構(gòu)建多個基因重組桿狀病毒在昆蟲細胞中 表達目的蛋白，即高通量構(gòu)建重組病毒表達目的蛋白。另外，該方法甚至可W利用重疊PCR 法一步克隆多個基因同時表達多種蛋白。
[0105] 與其他已公開的桿狀病毒重組方法相比，本發(fā)明公開的重組桿狀病毒無縫克隆方 法只需通過重疊PCR法合成包含目的基因的重組捶救DNA片段，無需構(gòu)建克隆目的基因的 中間載體，操作簡單，經(jīng)濟高效；重組捶救DNA片段與線性化復(fù)制缺陷型病毒載體共轉(zhuǎn)染 后，無需隧斑篩選純化，節(jié)省勞力；可適用于高通量構(gòu)建重組病毒，W及一步克隆多個基因 多重表達。
[0106] 最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 重組桿狀病毒無縫克隆的方法，其特征是：包括兩個主要構(gòu)成元件：可線性化的復(fù) 制缺陷型桿狀病毒載體和重組拯救DNA片段，上述兩個元件在昆蟲細胞內(nèi)直接重組產(chǎn)生重 組桿狀病毒。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒無縫克隆的方法，其特征是：所述線性化的復(fù) 制缺陷型桿狀病毒載體和重組拯救DNA片段在昆蟲細胞內(nèi)的DNA重組涉及到10-50bp長同 源臂的同源重組和/或非同源的末端連接。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組桿狀病毒無縫克隆的方法，其特征是： 所述可線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體為在病毒基因組中以細菌人工染色體片 段替代桿狀病毒多角體基因座及復(fù)制必需基因〇rfl629的3'端序列，并在BAC片段與 orfl629之間引入一個單酶切位點Bsu36I; 所述重組拯救DNA片段為一端包含orfl629缺失的3'端序列及其同源臂序列，另一端 包含或不包含BAC片段的同源臂。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒無縫克隆的方法，其特征是：可線性化的復(fù) 制缺陷型桿狀病毒載體，在與重組拯救DNA片段共轉(zhuǎn)染時利用Bsu36I酶切成線性的包含 orfl629末端和BAC末端的單個片段。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒無縫克隆的方法，其特征是：重組拯救DNA片 段，其一端包含的〇rfl629同源臂序列至少10bp長。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組桿狀病毒無縫克隆的方法，其特征是：所述重組拯救DNA 片段，可以是化學合成的，也可以是通過其他方法合成的包含除必需基因拯救DNA序列及 同源臂以外的其他序列DNA。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6所述的重組桿狀病毒無縫克隆的方法，其特征是： 無縫克隆方法為：是通過重組拯救DNA片段與線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體混 合，然后一起導(dǎo)入昆蟲細胞內(nèi)，通過同源重組和/或非同源的末端連接產(chǎn)生重組病毒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組桿狀病毒無縫克隆的方法，包括兩個主要構(gòu)成元件：可線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體和重組拯救DNA片段，上述兩個元件在昆蟲細胞內(nèi)直接重組產(chǎn)生重組桿狀病毒。線性化的復(fù)制缺陷型桿狀病毒載體和重組拯救DNA片段在昆蟲細胞內(nèi)的DNA重組涉及到10-50bp長同源臂的同源重組和/或非同源的末端連接。本發(fā)明可適用于高通量構(gòu)建重組病毒，以及一步克隆多個基因多重表達。
【IPC分類】C12N15/866
【公開號】CN105296538
【申請?zhí)枴緾N201510784301
【發(fā)明人】陳健, 錢月忠, 費偉強, 郝學敏, 陳琴
【申請人】杭州普萊柯生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月16日