一種檢測(cè)腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒危害程度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于評(píng)估腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒所帶來(lái)不同危害程度的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人類(lèi)巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)是一種人群中廣泛存在的DNA雙鏈病毒，是一種機(jī)會(huì)性病原體。在移植患者或其他應(yīng)用免疫抑制劑的免疫缺陷患者，HCMV感染是最常見(jiàn)的感染。具有免疫力的個(gè)體初次感染HCMV通常是無(wú)癥狀的，但在移植患者中感染的嚴(yán)重性與免疫抑制的程度卻成正比，HCMV感染是腎移植患者最常見(jiàn)的病毒感染并發(fā)癥。
[0003]移植的實(shí)體器官是HCMV感染的主要器官，移植患者HCMV感染所引發(fā)的臨床癥狀分兩大類(lèi):直接效應(yīng)(單核細(xì)胞增多樣綜合征或組織浸潤(rùn)性疾病)和間接效應(yīng)，當(dāng)發(fā)生高HCMV血癥、免疫組化檢測(cè)證實(shí)病毒感染時(shí)，就要高度懷疑HCMV組織浸潤(rùn)性疾病的發(fā)生。HCMV感染所致的間接效應(yīng)是由于長(zhǎng)期的病毒低水平復(fù)制，經(jīng)直接的或免疫介導(dǎo)的損傷導(dǎo)致宿主免疫功能紊亂引起的臨床征象，包括免疫抑制和移植物排斥，進(jìn)而影響移植物長(zhǎng)期存活。
[0004]目前常用熒光定量PCR法擴(kuò)增血漿、尿液等體液中HCMV DNA水平來(lái)監(jiān)測(cè)HCMV病毒載量。國(guó)內(nèi)以10，000拷貝/mL為閾值，高于此值時(shí)，認(rèn)為患者體內(nèi)有HCMV病毒高水平復(fù)制，處于HCMV感染活動(dòng)期，需要抗病毒治療。國(guó)外則以30，000拷貝/mL為閾值。HCMV DNA拷貝數(shù)反映病毒的復(fù)制能力，T細(xì)胞功能主要反映機(jī)體對(duì)病毒的清除能力。從患者體液中HCMV DNA拷貝數(shù)、T細(xì)胞功能等方面來(lái)評(píng)估HCMV感染對(duì)移植患者的危害，由于缺乏HCMV病毒感染對(duì)B淋巴細(xì)胞免疫功能危害的評(píng)估，故而并不能比較全面地反映免疫功能狀態(tài)。
[0005]病毒載量檢測(cè)建立在病毒復(fù)制本身，即使是低水平復(fù)制、沒(méi)有癥狀，病毒復(fù)制仍可直接或間接導(dǎo)致一些并發(fā)癥，而不僅僅是器官損害。因此有利于指導(dǎo)預(yù)防性用藥。特異的免疫應(yīng)答檢測(cè)建立在發(fā)生的并發(fā)癥和器官損害是與HCMV病相關(guān)，而不是HCMV復(fù)制，雖然說(shuō)對(duì)于確實(shí)需要藥物治療的患者更有效，但是待檢測(cè)到與HCMV病相關(guān)的異常免疫應(yīng)答時(shí)，其實(shí)已經(jīng)處于被動(dòng)的必須及時(shí)治療的狀態(tài)。腎移植患者HCMV感染后常常同時(shí)伴有非特異性和特異的免疫應(yīng)答，體現(xiàn)者之一即是B淋巴細(xì)胞高反應(yīng)活性狀態(tài)。
[0006]然而，個(gè)體情況不同的腎移植患者在感染同一 HCMV病毒情況下，對(duì)各自機(jī)體造成的危害并不相同。因此，如何很好地評(píng)估HCMV感染狀態(tài)以及對(duì)機(jī)體造成的危害程度，從而很好地防治HCMV感染是腎移植術(shù)后管理的重要目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提出一種用于模擬檢測(cè)不同腎移植患者在感染巨細(xì)胞病毒后反映⑶19+B淋巴細(xì)胞表型和生物學(xué)活性的方法。
[0008]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的技術(shù)方案是:一種檢測(cè)腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒危害程度的方法，包括以下步驟:
[0009]a、采血，采集該腎移植患者的肝素鈉抗凝外周血20mL ;
[0010]b、⑶19+B淋巴細(xì)胞的獲取及分析，從淋巴細(xì)胞分離液中分離單個(gè)核細(xì)胞，以磁珠分選所述外周血中⑶19+B淋巴細(xì)胞；
[0011]c、制備人巨細(xì)胞病毒毒種和定量；
[0012]d、體外培養(yǎng)⑶19+B淋巴細(xì)胞并對(duì)其分別進(jìn)行HCMV病毒的直接刺激和間接刺激；
[0013]e、流式檢測(cè)在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下BAFF受體在所述⑶19+B淋巴細(xì)胞上的表達(dá)，并獲得檢測(cè)結(jié)果；
[0014]f、檢測(cè)在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下⑶19+B淋巴細(xì)胞的凋亡率，并獲得檢測(cè)結(jié)果；
[0015]g、ELI SPOT法檢測(cè)在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下⑶19+B淋巴細(xì)胞分泌IgG的能力，并獲得檢測(cè)結(jié)果。
[0016]進(jìn)一步的，所述步驟c中包括以下操作子步驟:
[0017]1、用含10% FBS的F12K完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞至長(zhǎng)滿瓶底；
[0018]i1、棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，加lmL病毒液，置于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中吸附病毒2小時(shí)；
[0019]ii1、棄掉病毒液，加含2% FBS的F12K維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0020]iv、至細(xì)胞病變80%以上時(shí)收獲細(xì)胞；
[0021]V、_80°C和常溫反復(fù)凍融3次，382g離心lOmin取上清，分裝并保存至_80°C ；
[0022]v1、Reed-Muench法測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染量。
[0023]進(jìn)一步的，所述步驟d中包括以下操作子步驟:
[0024]1、獲得HCMV病毒直接刺激組，于六孔板中每孔加lmL 10倍無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的HCMV AD-169病毒懸液懸浮的⑶19+B淋巴細(xì)胞，其中5 X 105細(xì)胞/孔，在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中、每隔15分鐘搖勻一次、吸附2h，之后每孔再加lmL含20% FBS、2%雙抗的1640培養(yǎng)基混勻，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3天；
[0025]i1、獲得HCMV病毒間接刺激組，先將人肺成纖維細(xì)胞與⑶19+B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，其中人肺成纖維細(xì)胞按2 X 105細(xì)胞/孔鋪6孔板，待細(xì)胞鋪滿板底，棄上清，每孔加lmLlO倍無(wú)血清F12K稀釋的HCMV AD-169病毒原液，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中吸附病毒2小時(shí)，加2mL含胎牛血清的F12K維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2天，棄上清，每孔加2mL1640完全培養(yǎng)基懸浮的⑶19+B淋巴細(xì)胞5X 105個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
[0026]本發(fā)明的有益效果是:
[0027]本發(fā)明中的檢測(cè)方法在患者尚未感染HCMV病毒之前，進(jìn)行分析患者B淋巴細(xì)胞對(duì)HCMV病毒刺激的反應(yīng)。如果患者B淋巴細(xì)胞在HCMV刺激后，細(xì)胞膜分子BAFF-R表達(dá)持續(xù)增高、BAFF信號(hào)阻斷使B淋巴細(xì)胞在HCMV刺激后凋亡率明顯增高時(shí)，認(rèn)為患者如果感染HCMV后，B淋巴細(xì)胞將發(fā)生異常高反應(yīng)活性。此時(shí)，患者發(fā)生慢性排斥的幾率大大提高，并且影響移植腎長(zhǎng)期存活率。患者需要提前進(jìn)行抗病毒治療，減少感染HCMV的風(fēng)險(xiǎn)，并考慮改變免疫抑制劑組合。
[0028]因此，本發(fā)明對(duì)于評(píng)估腎移植患者HCMV感染導(dǎo)致的慢性排斥這一間接效應(yīng)具有重要價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0029]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒危害程度的方法作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0030]圖1是本發(fā)明中檢測(cè)腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒危害程度的方法的邏輯示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例一
[0032]本實(shí)施例是針對(duì)甲腎移植患者在術(shù)后進(jìn)行用于評(píng)估感染巨細(xì)胞病毒所帶來(lái)危害程度的檢測(cè)方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0033]步驟a、采血，采集甲腎移植患者的肝素鈉抗凝外周血20mL。
[0034]步驟b、⑶19+B淋巴細(xì)胞的獲取及分析，以淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)(購(gòu)自天津?yàn)笊锕?分離單個(gè)核細(xì)胞，以磁珠分選外周血中⑶19+B淋巴細(xì)胞。磁珠分選細(xì)胞包括以下子步驟:
[0035](1)取適量單個(gè)核細(xì)胞懸液，100g離心5分鐘，棄上清；
[0036](2)按每107個(gè)細(xì)胞加80 μ 1 MACS緩沖液，輕輕吹散細(xì)胞，混勻；
[0037](3)按每80 μ 1 MACS緩沖液加20 μ 1 CD19磁珠，混勻，4°C孵育15分鐘；
[0038](4)按每107個(gè)細(xì)胞加l-2mL MACS緩沖液混勻，100g，10分鐘離心，棄上清；
[0039](5)按每10s個(gè)細(xì)胞重懸于500 μ 1 MACS緩沖液中；
[0040](6)按照細(xì)胞數(shù)選擇LS柱和MidiMACS分離器，安裝好分選裝置(所需MACS分離柱和分離器根據(jù)細(xì)胞數(shù)選擇)；
[0041 ] (7)用MACS緩沖液潤(rùn)濕分離柱，廢液缸收集廢液；
[0042](8)將(5)中所得細(xì)胞懸液緩慢加入分離柱中，標(biāo)記的目的細(xì)胞滯留在柱子內(nèi)，未標(biāo)記的細(xì)胞則流出；
[0043](9)用3mL的MACS緩沖液清洗離心管3次；
[0044](10)從分離裝置上取下分離柱，置于目的細(xì)胞收集管上，加5mL MACS緩沖液，迅速洗脫目的細(xì)胞；
[0045](11)離心，棄上清，加培養(yǎng)基重懸備用，使細(xì)胞密度約為2 X105個(gè)/mL。
[0046]步驟c、人巨細(xì)胞病毒(HCMV AD-169)毒種(購(gòu)自武漢大學(xué)病毒研究所)的制備，包括以下子步驟:
[0047](1)用含10% FBS(胎牛血清，下同)的F12K完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞(HFL-1)至長(zhǎng)滿瓶底(90%左右)；
[0048](2)棄培養(yǎng)基，PBS(磷酸鹽緩沖液，下同)洗兩遍，加lmL病毒液，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中吸附病毒2小時(shí)；
[0049](3)棄掉病毒液，加含2% FBS的F12K維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0050](4)至細(xì)胞病變80 %以上時(shí)(一般4-6d)收獲細(xì)胞；
[0051](5)-80°C和常溫反復(fù)凍融3次，382g離心lOmin取上清，分裝并保存至_80°C ；
[0052](6)Reed-Muench法測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(Tissue culture infect1n dose，TCID50)。HCMV病毒感染HFL-1細(xì)胞致細(xì)胞病變，Reed-Muench法應(yīng)用公式為:距離比例(PD)=(高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)-低于50%的死亡百分?jǐn)?shù))，logTCID50 = log(高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)的稀釋度)+ (Η)Χ稀釋倍數(shù))。
[0053]步驟d、⑶19+B淋巴細(xì)胞的HCMV病毒直接和間接刺激體外培養(yǎng)，將分選得到的CD19+B淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別以HCMV病毒直接或間接刺激。觀察不同刺激因素下，⑶19+B淋巴細(xì)胞表型及細(xì)胞凋亡率的變化、以及分泌IgG水平的變化。
[0054]HCMV病毒直接刺激組:于六孔板中每孔加lmL 10倍無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的HCMV AD-169病毒懸液懸浮的CD19+B淋巴細(xì)胞(5X 105細(xì)胞/孔)，37°C、5%