血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的HCMV AD-169病毒懸液懸浮的CD19+B淋巴細(xì)胞(5X 105細(xì)胞/孔)，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中、每隔15分鐘搖勻一次、吸附2h，之后每孔再加lmL含20% FBS、2%雙抗的1640培養(yǎng)基混勻，于37°C 5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3天。
[0115]HCMV病毒間接刺激組:首先HFL-1細(xì)胞與⑶19+B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)(HFL-1細(xì)胞按2X 105細(xì)胞/孔鋪6孔板，待細(xì)胞鋪滿板底，棄上清，每孔加lmLlO倍無血清F12K稀釋的HCMV AD-169病毒原液，37°C 5% C02培養(yǎng)箱中吸附病毒2小時(shí)，加2mL含胎牛血清的F12K維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2天。棄上清，每孔加2mL1640完全培養(yǎng)基懸浮的CD19+B淋巴細(xì)胞5X105個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
[0116]rBAFF刺激組:將rBAFF 200ng/mL加入CD19+B淋巴細(xì)胞(5 X 105細(xì)胞/孔)培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
[0117]BAFF信號(hào)阻斷組:用10 μ g/mL抗BAFF-R抗體在HCMV刺激CD19+B淋巴細(xì)胞之前或之后兩小時(shí)加入⑶19+B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
[0118]陰性對(duì)照組:相同數(shù)量⑶19+B淋巴細(xì)胞中加入等量的無血清F12K培養(yǎng)基為一組陰性對(duì)照，等量⑶19+B淋巴細(xì)胞加入等量1640培養(yǎng)基為第二組陰性對(duì)照，未以HCMV刺激的HFL-1細(xì)胞與等量⑶19+B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)為另一組陰性對(duì)照。培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件相同。
[0119]步驟e、流式檢測(cè)不同條件下BAFF受體在B淋巴細(xì)胞上的表達(dá)，取部分細(xì)胞懸液(每管約105個(gè)細(xì)胞)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)純化后的⑶19 +B淋巴細(xì)胞上BAFF、BAFF-R、TAC1、和BCMA的表達(dá)水平。以CFS標(biāo)記抗人BAFF單抗、PE標(biāo)記抗人BAFF-R單抗、PE標(biāo)記抗人TACI單抗、和BCMA多抗+驢抗羊IgG 二抗(均購(gòu)自R&D公司)進(jìn)行標(biāo)記。4°C孵育1小時(shí)后，PBS洗2遍，加400 μ L鞘液上機(jī)檢測(cè)。
[0120]檢測(cè)結(jié)果顯示，乙腎移植患者外周血⑶19+Β淋巴細(xì)胞在HCMV直接刺激下，BAFF-R表達(dá)維持在原有水平。在HCMV間接刺激下BAFF-R表達(dá)水平逐漸下降。
[0121]步驟f、檢測(cè)⑶19+B淋巴細(xì)胞凋亡率，BAFF信號(hào)阻斷組，取部分細(xì)胞，按照PEAnnexin V凋亡試劑盒說明處理細(xì)胞，用Annexin V及7-AAD雙染后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。包括以下操作子步驟:
[0122](1)將待測(cè)細(xì)胞用冷的PBS洗兩遍；
[0123](2) IX反應(yīng)緩沖液重懸，使得細(xì)胞密度約為IX 106cells/mL ；
[0124](3)取100 μ L細(xì)胞懸液至5mL流式管中；
[0125](4)每管加5 μ L PE-Annexin V和5 μ L 7-AAD,輕柔混勻后室溫孵育15分鐘；
[0126](5)每管加400 μ L IX反應(yīng)緩沖液混勻，上機(jī)檢測(cè)。
[0127]檢測(cè)結(jié)果顯示，乙腎移植患者外周血⑶19+Β淋巴細(xì)胞在HCMV直接刺激作用下，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，與HCMV間接刺激組及其他對(duì)照組比較沒有明顯差異。BAFF信號(hào)阻斷與HCMV刺激作用的先后對(duì)⑶19+Β淋巴細(xì)胞凋亡率沒有明顯作用。
[0128]步驟g、ELI SPOT法檢測(cè)⑶19+B淋巴細(xì)胞分泌IgG能力，包括以下子步驟:
[0129](l)ELISpot 板準(zhǔn)備
[0130]1)以無菌PBS(pH7.4)稀釋抗原至濃度為50 μ g/mL、稀釋單抗ΜΤ91/145至濃度為15 μg/mL ；
[0131]2)包被前將PVDF膜用酒精進(jìn)行處理。每孔以70%酒精浸潤(rùn)2分鐘后，立即將板進(jìn)行清洗；
[0132]3)倒去酒精，以無菌水洗板，每孔200 μ L ;
[0133]4)每孔加100 μ L抗原稀釋液于4°C過夜進(jìn)行包被；
[0134](2)無菌條件下將⑶19+B淋巴細(xì)胞鋪板
[0135]1)洗板，倒去液體，以無菌PBS洗板5次，清除未結(jié)合的抗體；
[0136]2)封閉。每孔加入200 μ L含10%血清的培養(yǎng)基，室溫孵育至少30分鐘；
[0137]3)各取以下各組細(xì)胞(未處理組、只HCMV刺激組、只抗BAFF-R單抗刺激組、先HCMV刺激2小時(shí)后加抗BAFF-R單抗組、先抗BAFF-R單抗刺激2小時(shí)后加HCMV刺激組)8 X 104/孔加入培養(yǎng)板中，每組設(shè)復(fù)孔；
[0138]4)將板置于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中孵育16-24小時(shí)。期間不能移動(dòng)培養(yǎng)板。為防止蒸發(fā)，用鋁箔將板進(jìn)行包裹。
[0139](3)斑點(diǎn)檢測(cè)
[0140]1)以PBS每孔200 μ L洗板，清除細(xì)胞；
[0141]2)以含0.5%胎牛血清的PBS(PBS-0.5% FCS)稀釋檢測(cè)用抗體ΜΤ78/145，至1 μ g/mL,每孔加100 μ L，室溫孵育2小時(shí)；
[0142]3)洗板，倒去液體，以無菌PBS洗板5次，清除未結(jié)合的抗體；
[0143]4)以PBS-0.5% FCS稀釋抗生物素鏈菌蛋白-HRP，每孔加100 μ L，室溫孵育1小時(shí)；
[0144]5)洗板，倒去液體，以無菌PBS洗板5次，清除未結(jié)合的抗體；
[0145]6)每孔加100 μ L底物(ΤΜΒ)，孵育，直到出現(xiàn)斑點(diǎn)；
[0146]7)以去離子水沖洗，終止顏色反應(yīng)；
[0147]8)將板干燥。顯微鏡下計(jì)數(shù)斑點(diǎn)；
[0148]9)將板置于室溫避光保存。
[0149]結(jié)果顯示:乙腎移植患者外周血⑶19+Β淋巴細(xì)胞在HCMV直接刺激作用下分泌IgG的能力沒有明顯增強(qiáng)d^BAFF-R單抗與HCMV刺激雙重作用下，⑶19+B淋巴細(xì)胞分泌IgG能力沒有明顯增高(分別于未處理組、抗BAFF-R單抗及對(duì)照組比較，P > 0.05)。
[0150]通過上述方法檢測(cè)乙腎移植患者外周血⑶19+B淋巴細(xì)胞對(duì)HCMV刺激的反應(yīng)，觀察⑶19+B淋巴細(xì)胞對(duì)BAFF信號(hào)的敏感性?？梢钥闯鲈摶颊撷?9+B淋巴細(xì)胞在HCMV刺激下細(xì)胞BAFF-R的表達(dá)沒有維持在高水平，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，細(xì)胞分泌IgG能力沒有明顯增強(qiáng)。推測(cè)該患者如果并發(fā)HCMV感染，并不會(huì)引起CD19+B淋巴細(xì)胞高反應(yīng)性，對(duì)于腎移植長(zhǎng)期結(jié)局沒有顯著影響。臨床上需要囑咐定期復(fù)查。
[0151 ] 本發(fā)明的不局限于上述實(shí)施例，本發(fā)明的上述各個(gè)實(shí)施例的技術(shù)方案彼此可以交叉組合形成新的技術(shù)方案，另外凡采用等同替換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒危害程度的方法，包括以下特征步驟: a、采血，采集該腎移植患者的肝素鈉抗凝外周血20mL; b、CD19+B淋巴細(xì)胞的獲取及分析，從淋巴細(xì)胞分離液中分離單個(gè)核細(xì)胞，以磁珠分選所述外周血中⑶19+B淋巴細(xì)胞； c、制備人巨細(xì)胞病毒毒種和定量； d、體外培養(yǎng)CD19+B淋巴細(xì)胞并對(duì)其分別進(jìn)行HCMV病毒的直接刺激和間接刺激； e、流式檢測(cè)在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下BAFF受體在所述CD19+B淋巴細(xì)胞上的表達(dá)，并獲得檢測(cè)結(jié)果； f、檢測(cè)在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下CD19+B淋巴細(xì)胞的凋亡率，并獲得檢測(cè)結(jié)果； g、ELISPOT法檢測(cè)在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下⑶19+B淋巴細(xì)胞分泌IgG的能力，并獲得檢測(cè)結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒危害程度的方法，其特征在于，所述步驟c中包括以下操作子步驟: i、用含10%FBS的F12K完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞至長(zhǎng)滿瓶底； ii、棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，加lmL病毒液，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中吸附病毒2小時(shí)； iii、棄掉病毒液，加含2%FBS的F12K維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)； iv、至細(xì)胞病變80%以上時(shí)收獲細(xì)胞； V、-80°C和常溫反復(fù)凍融3次，382g離心lOmin取上清，分裝并保存至_80°C ； vi、Reed-Muench法測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染量。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述，檢測(cè)腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒危害程度的方法，其特征在于，所述步驟d中包括以下操作子步驟: i、獲得HCMV病毒直接刺激組，于六孔板中每孔加lmL10倍無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的HCMV AD-169病毒懸液懸浮的⑶19+B淋巴細(xì)胞，其中5X 105細(xì)胞/孔，在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中、每隔15分鐘搖勻一次、吸附2h，之后每孔再加lmL含20% FBS、2%雙抗的.1640培養(yǎng)基混勻，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3天； ii、獲得HCMV病毒間接刺激組，先將人肺成纖維細(xì)胞與CD19+B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，其中人肺成纖維細(xì)胞按2 X 105細(xì)胞/孔鋪6孔板，待細(xì)胞鋪滿板底，棄上清，每孔加lmL 10倍無血清F12K稀釋的HCMV AD-169病毒原液，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中吸附病毒2小時(shí)，加2mL含胎牛血清的F12K維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2天，棄上清，每孔加2mL 1640完全培養(yǎng)基懸浮的⑶19+B淋巴細(xì)胞5X 105個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)腎移植患者在術(shù)后感染巨細(xì)胞病毒危害程度的方法，包括以下步驟：a、采血；b、CD19+B淋巴細(xì)胞的獲取及分析；c、制備人巨細(xì)胞病毒毒種和定量；d、體外培養(yǎng)CD19+B淋巴細(xì)胞并對(duì)其分別進(jìn)行HCMV病毒的直接刺激和間接刺激；e、流式檢測(cè)BAFF受體在所述CD19+B淋巴細(xì)胞上的表達(dá)；f、檢測(cè)CD19+B淋巴細(xì)胞的凋亡率；g、檢測(cè)CD19+B淋巴細(xì)胞分泌IgG的能力。本發(fā)明中的檢測(cè)方法可以分析患者B淋巴細(xì)胞對(duì)HCMV病毒刺激的反應(yīng)。本發(fā)明對(duì)于評(píng)估腎移植患者HCMV感染導(dǎo)致的慢性排斥這一間接效應(yīng)具有重要價(jià)值。
【IPC分類】C12N5/0784, C12Q1/02
【公開號(hào)】CN105296588
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510670392
【發(fā)明人】徐海燕, 何小舟, 馬旭怡, 宋丹
【申請(qǐng)人】常州市第一人民醫(yī)院
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日