一種動(dòng)物軟骨源的未變性ii型膠原及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種動(dòng)物軟骨源的未變性II型膠原的制備方法，屬生物醫(yī)用材料制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]II型膠原是構(gòu)成軟骨基質(zhì)的主要成分之一，其與I型膠原相似，是纖維形成膠原，由三條相同的αΙ(ΙΙ)鏈組成三股螺旋結(jié)構(gòu)域，其分子不含色氨酸殘基，酪氨酸殘基含量也較少，因此其分子的抗原性較低，尤其是酶法制得的II型膠原，在除去了分子鏈的端肽后，其免疫原性更低。軟骨中II型膠原分子之間通過(guò)共價(jià)鍵搭橋交聯(lián)，形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，II型膠原富含的羥賴氨酸又與多糖共價(jià)鍵結(jié)合，更加穩(wěn)定了 II型膠原的天然空間結(jié)構(gòu)，這有利于保護(hù)軟骨的結(jié)構(gòu)及軟骨的生物活性，并維持天然軟骨的力學(xué)性能和機(jī)械穩(wěn)定性。同時(shí)，天然II型膠原的空間結(jié)構(gòu)決定了其在水中溶解度很低，不利于II型膠原的分離提純。因此在提取過(guò)程中很好地維持膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)，不致因過(guò)度處理而使膠原進(jìn)一步分解而喪失所具備的生理活性，顯得尤為重要。迄今為止，II型膠原的提取制備方法主要為酸法、堿法、酶法、結(jié)合法、中性鹽法以及熱水抽提法等六種，每種方法所制得的II型膠原的分子結(jié)構(gòu)與性能存在顯著區(qū)別，其中，堿法、熱水抽提法所得II型膠原分子量低、分布較寬，不具備生物活性；酸法、中性鹽法所得II型膠原因未有效地除去其分子端肽，可能會(huì)使II型膠原具有一定的免疫原性，影響其生物學(xué)應(yīng)用，且所得膠原提取率過(guò)低，不易工業(yè)化生產(chǎn)；酶法制取的II型膠原能完整保留其分子結(jié)構(gòu)，提取率也相對(duì)較高，最適合大規(guī)模生產(chǎn)。然而酶法在制備II型膠原過(guò)程中膠原的純度與產(chǎn)率之間存在矛盾，如果產(chǎn)率高，純度就會(huì)達(dá)不到要求，因此兼顧高產(chǎn)率與高純度的II型膠原提取制備工藝至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供的一種動(dòng)物軟骨源的未變性II型膠原的制備方法，其特點(diǎn)是該方法制備的未變性的II膠原產(chǎn)率、純度高，生物活性高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定易于保存，有利于軟骨細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖，可用于醫(yī)用生物材料的制備。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
(1)動(dòng)物軟骨的前處理:取新鮮可溯源的動(dòng)物軟骨100?200份，用剪刀手工清除殘留骨頭、肌肉，接著在不銹鋼轉(zhuǎn)鼓中用生理鹽水反復(fù)清洗3?5次，瀝水30?60min ;將動(dòng)物軟骨放入-40?-80°C的速凍冰箱中反復(fù)凍融5?10次，接著將其浸泡在1000?10000體積份的脫脂劑中，伴隨間歇性功率為50?100W超聲波，每作用30?60min停10_30min，反復(fù)作用3?5次，中途換液2?5次，用0.05M Tris，1M NaCl，pH為7.5的Tris-NaCl緩沖溶液清洗3?5次，再將其浸泡在2?3.5M NaCl，20?40mM EDTA的高滲溶液中，37°C下攪拌10?20h，瀝水30?60min ;將動(dòng)物軟骨繼續(xù)浸泡在pH2.0?2.5，1000?5000體積份的醋酸溶液2?10h，紗布過(guò)濾回收醋酸溶液，去離子水清洗3?5次，用0.1?1M，1000?5000體積份的NaOH溶液軟化處理10_24h，去離子水清洗3?5次，冷凍干燥，得到純化的動(dòng)物軟骨；將動(dòng)物軟骨采用低溫超微粉碎機(jī)粉碎，干燥器中保存待用；
(2)未變性II型膠原的提取:將100?200份動(dòng)物軟骨粉浸泡在1000?2000體積份含有4M鹽酸胍的0.05M Tris, 1M NaCl，pH為7.5的Tris-NaCl緩沖溶液中，室溫下攪拌10?36h，接著10000?20000rpm離心10?30min，回收上清液，用去離子水反復(fù)清洗沉淀物，將沉淀物浸泡在PH2.0?2.5，3000?10000體積份的醋酸溶液，在恒溫4?10°C下緩慢攪拌3?10h，接著加入1?4份復(fù)合酶，4?10°C下轉(zhuǎn)動(dòng)24?72h，得到酶溶動(dòng)物軟骨
II型膠原溶液；
(3)未變性II型膠原的純化:向上述所得到的動(dòng)物軟骨II型膠原溶液中加入最終濃度為0.9mol/L的氣化納粉末，4?10°C下攬摔10?16h，10000?20000rpm離心10?30min，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，用5?10M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5?7.5，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，4?10°C下攪拌10?16h，接著10000?20000rpm離心10?30min，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，再用5?10M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5?7.5，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，4?10°C下攪拌10?16h，再次以10000?20000rpm離心10?30min，取下層沉淀物，如此反復(fù)鹽析3?5次；將鹽析后得到的沉淀再溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，以濃度為0.1?0.5M的乙酸溶液為透析液透析處理2-3天，凍干，得到海綿狀未變性的動(dòng)物軟骨II型膠原；所制得的動(dòng)物軟骨II型膠原，其關(guān)鍵性能達(dá)到以下指標(biāo)要求:
外觀:白色海綿狀，無(wú)肉眼可見(jiàn)之雜質(zhì)和變色；
色氨酸分析:應(yīng)不含有色氨酸；
重金屬含量:彡10 μ g/g(m/m)；
輕脯氨酸含量:應(yīng)不小于總蛋白含量的8.5%(m/m)；
脂質(zhì)體:彡l%(m/m)；
灰分:< 2% (m/m)；
雜蛋白含量:彡l%(m/m);
細(xì)胞毒性:細(xì)胞毒性反應(yīng)不大于1級(jí)；
無(wú)菌試驗(yàn):無(wú)菌；
致敏試驗(yàn):無(wú)遲發(fā)性超敏反應(yīng)；
皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn):原發(fā)性刺激指數(shù)ΡΙΚ0.4。
[0005]在上述的制備方法中，步驟(1)中低溫超微粉碎機(jī)，北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；步驟(1)中超聲時(shí)間視所用超聲波功率的不同而不同；步驟(1)中復(fù)合酶中胃蛋白酶的活力單位為3000單位/克，木瓜蛋白酶活力單位為800萬(wàn)單位/克，葡聚糖酶的活力單位為50單位/克；制備過(guò)程均在4?10°C下完成。
[0006]本專利技術(shù)通過(guò)反復(fù)凍融、超聲脫脂、高滲液脫細(xì)胞、酸-堿交替軟化等工藝對(duì)動(dòng)物軟骨進(jìn)行前處理，可有效除去軟骨的非膠原成分，進(jìn)一步松散了動(dòng)物軟骨中的膠原纖維，增加了動(dòng)物軟骨的膠原纖維間空隙，極有利于提取過(guò)程中生物酶的充分滲透和作用，能有效提高膠原的純度和產(chǎn)率；復(fù)合酶各組分的協(xié)同作用，可最大限度地除去膠原的端肽，降低其的免疫原性。
[0007]未變性II型膠原有以下用途:
1.用作生物醫(yī)學(xué)材料的原料，如可用作制備藥物控釋載體、止血材料、硬腦膜修復(fù)材料、組織工程支架、組織引導(dǎo)材料、整形美容材料等的原料；
2.用作化妝品材料的原料，如護(hù)膚霜、潤(rùn)發(fā)劑等的原料；
3.用作食品工業(yè)材料的原料，如保健材料、飲料等的原料；
4.其他，如用作細(xì)胞培養(yǎng)用、生物反應(yīng)器單體膜等。
[0008]本技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
(1)本發(fā)明在動(dòng)物軟骨純化過(guò)程中使用了超聲波，充分發(fā)揮了超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)等作用，破壞了軟骨中細(xì)胞的細(xì)胞膜，有利于對(duì)軟骨的進(jìn)一步脫脂和去細(xì)胞處理；
(2)本發(fā)明采用復(fù)合酶提取II型膠原，復(fù)合酶組份間的協(xié)同作用極有利于對(duì)動(dòng)物軟骨中的非膠原成分、雜細(xì)胞及膠原端肽進(jìn)行清除，能有效地提高膠原的產(chǎn)率和純度；
(3)本發(fā)明所述的II型膠原制備工藝，先將動(dòng)物軟骨通過(guò)反復(fù)凍融、超聲脫脂、高滲液脫細(xì)胞、酸-堿交替軟化等工藝進(jìn)行了純化處理，充分除去了軟骨中的非膠原成分，松散了軟骨中的膠原纖維，能有效地提高膠原的產(chǎn)率和純度；
(4)本發(fā)明所制備的II型膠原的取材豐富，成本低廉，技術(shù)先進(jìn)可靠，產(chǎn)量大，適合批量生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面通過(guò)實(shí)施對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容作出非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
[0010]實(shí)施例1
(1)動(dòng)物軟骨的前處理:取新鮮可溯源的動(dòng)物軟骨100份，用剪刀手工清除殘留骨頭、肌肉，接著用生理鹽水反復(fù)清洗3次，瀝水30min ;將動(dòng)物軟骨放入_40°C的速凍冰箱中反復(fù)凍融5次，接著在不銹鋼轉(zhuǎn)鼓中將其浸泡在1000體積份的脫脂劑中，伴隨間歇性功率為50W超聲波每作用60min停30min，反復(fù)作用5次，中途換液5次，用0.05M Tris，1MNaCl, pH為7.5的Tris-NaCl緩沖溶液清洗3次，再將其浸泡在2M NaCl,20mM EDTA的高滲溶液中，37°C下攪拌10h，瀝水30min ;將動(dòng)物軟骨繼續(xù)浸泡在pH2.0，1000體積份的醋酸溶液2h，紗布過(guò)濾回收醋酸溶液，去離子水清洗3次，用0.1M，1000體積份的NaOH溶液軟化處理10h，去離子水清洗3次，冷凍干燥，得到純化的動(dòng)物軟骨；將動(dòng)物軟骨采用低溫超微粉碎機(jī)粉碎，干燥器中保存待用；
(2)未變性11型膠原的提取:將100份動(dòng)物軟骨粉浸泡在1000體積份含有4M鹽酸胍的0.05M Tris, 1M NaCl，pH 為 7.5 的 Tris-NaCl 緩沖溶液中，室溫下攪拌 10h，接著 lOOOOrpm離心30min，回收上清液，用去離子水反復(fù)清洗沉淀物，將沉淀物浸泡在pH2.0，3000體積份的醋酸溶液，在恒溫4°C下緩慢攪拌3h，接著加入1份復(fù)合酶，4°C下轉(zhuǎn)動(dòng)72h，得到酶溶動(dòng)物軟骨II型膠原溶液；
(3)未變性II型膠原的純化:向上述所得到的動(dòng)物軟骨II型膠原溶液中加入最終濃度為0.9mol/L的氯化鈉粉末，4°C下攪拌10h，lOOOOrpm離心30min，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.lmol/L醋酸溶液，用5M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，4°C下攪拌10h，接著lOOOOrpm離心30min，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.lmol/L醋酸溶液，再用5M NaOH溶液調(diào)節(jié)p