H值為6.5，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，4°C下攪拌10h，再次以lOOOOrpm離心30min，取下層沉淀物，如此反復(fù)鹽析3次；將鹽析后得到的沉淀再溶于0.lmol/L醋酸溶液，以濃度為0.1M的乙酸溶液為透析液透析處理2天，凍干，得到海綿狀未變性的動物軟骨II型膠原。
[0011]實施例2
(1)動物軟骨的前處理:取新鮮可溯源的動物軟骨150份，用剪刀手工清除殘留骨頭、肌肉，接著在不銹鋼轉(zhuǎn)鼓中用生理鹽水反復(fù)清洗4次，瀝水40min ;將動物軟骨放入_50°C的速凍冰箱中反復(fù)凍融8次，接著將其浸泡在4500體積份的脫脂劑中，伴隨間歇性功率為60W超聲波每作用40min停20min，反復(fù)作用4次，中途換液3次，用0.05M Tris，1MNaCl, pH為7.5的Tris-NaCl緩沖溶液清洗4次，再將其浸泡在3M NaCl,30mM EDTA的高滲溶液中，37°C下攪拌15h，瀝水40min ;將動物軟骨繼續(xù)浸泡在pH2.2，4500體積份的醋酸溶液8h，紗布過濾回收醋酸溶液，去離子水清洗4次，用0.5M，4500體積份的NaOH溶液軟化處理18h，去離子水清洗4次，冷凍干燥，得到純化的動物軟骨；將動物軟骨采用低溫超微粉碎機粉碎，干燥器中保存待用；
(2)未變性II型膠原的提取:將150份動物軟骨粉浸泡在1500體積份含有4M鹽酸胍的0.05M Tris, 1M NaCl, pH為7.5的Tris-NaCl緩沖溶液中，室溫下攪拌10?36h，接著15000rpm離心20min，回收上清液，用去離子水反復(fù)清洗沉淀物，將沉淀物浸泡在pH2.2，4500體積份的醋酸溶液，在恒溫5°C下緩慢攪拌5h，接著加入3份復(fù)合酶，5°C下轉(zhuǎn)動36h，得到酶溶動物軟骨II型膠原溶液；
(3)未變性II型膠原的純化:向上述所得到的動物軟骨II型膠原溶液中加入最終濃度為0.9mol/L的氯化鈉粉末，5°C下攪拌14h，15000rpm離心20min，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.2mol/L醋酸溶液，用8M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，5 °C下攪拌12h，接著15000rpm離心20min，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.2mol/L醋酸溶液，再用8M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，5°C下攪拌12h，再次以15000rpm離心20min，取下層沉淀物，如此反復(fù)鹽析4次；將鹽析后得到的沉淀再溶于0.2mol/L醋酸溶液，以濃度為0.2M的乙酸溶液為透析液透析處理2天，凍干，得到海綿狀未變性的動物軟骨II型膠原。
[0012]實施例3
(1)動物軟骨的前處理:取新鮮可溯源的動物軟骨200份，用剪刀手工清除殘留骨頭、肌肉，接著用生理鹽水反復(fù)清洗5次，瀝水60min ;將動物軟骨放入_80°C的速凍冰箱中反復(fù)凍融10次，接著在不銹鋼轉(zhuǎn)鼓中將其浸泡在10000體積份的脫脂劑中，伴隨間歇性功率為100W超聲波每作用30min停lOmin，反復(fù)作用3次，中途換液2次，用0.05M Tris，1MNaCl，pH為7.5的Tris-NaCl緩沖溶液清洗5次，再將其浸泡在3.5M NaCl，40mM EDTA的高滲溶液中，37°C下攪拌20h，瀝水60min ;將動物軟骨繼續(xù)浸泡在pH2.5，5000體積份的醋酸溶液2h，紗布過濾回收醋酸溶液，去離子水清洗5次，用1M，5000體積份的NaOH溶液軟化處理24h，去離子水清洗5次，冷凍干燥，得到純化的動物軟骨；將動物軟骨采用低溫超微粉碎機粉碎，干燥器中保存待用；
(2)未變性11型膠原的提取:將200份動物軟骨粉浸泡在2000體積份含有4M鹽酸胍的
0.05M Tris，lM NaCl，pH 為 7.5 的 Tris-NaCl 緩沖溶液中，室溫下攪拌 36h，接著 20000rpm離心lOmin，回收上清液，用去離子水反復(fù)清洗沉淀物，將沉淀物浸泡在pH2.5，10000體積份的醋酸溶液，在恒溫10°C下緩慢攪拌10h，接著加入4份復(fù)合酶，10°C下轉(zhuǎn)動24h，得到酶溶動物軟骨II型膠原溶液；
(3)未變性II型膠原的純化:向上述所得到的動物軟骨II型膠原溶液中加入最終濃度為0.9mol/L的氯化鈉粉末，10°C下攪拌16h，20000rpm離心lOmin，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.5mol/L醋酸溶液，用10M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，10°c下攪拌16h，接著20000rpm離心lOmin，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.5mol/L醋酸溶液，再用10M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，10°c下攪拌16h，再次以20000rpm離心lOmin，取下層沉淀物，如此反復(fù)鹽析5次；將鹽析后得到的沉淀物再溶于0.5mol/L醋酸溶液，以濃度為0.5M的乙酸溶液為透析液透析處理3天，凍干，得到海綿狀未變性的動物軟骨II型膠原。
【主權(quán)項】
1.一種動物軟骨源的未變性II型膠原的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟:所述原料份數(shù)按重量計 (1)動物軟骨的前處理:取新鮮可溯源的動物軟骨100?200份，用剪刀手工清除殘留骨頭、肌肉，接著在不銹鋼轉(zhuǎn)鼓中用生理鹽水反復(fù)清洗3?5次，瀝水30?60min ;將動物軟骨放入-40?-80°C的速凍冰箱中反復(fù)凍融5?10次，接著將其浸泡在1000?10000體積份的脫脂劑中，伴隨間歇性功率為50?100W超聲波，每作用30?60min停10_30min，反復(fù)作用3?5次，中途換液2?5次，用0.05M Tris, IM NaCl，pH為7.5的Tris-NaCl緩沖溶液清洗3?5次，再將其浸泡在2?3.5M NaCl，20?40mM EDTA的高滲溶液中，37°C下攪拌10?20h，瀝水30?60min ;將動物軟骨繼續(xù)浸泡在pH2.0?2.5，1000?5000體積份的醋酸溶液2?10h，紗布過濾回收醋酸溶液，去離子水清洗3?5次，用0.1?1M，1000?5000體積份的NaOH溶液軟化處理10_24h，去離子水清洗3?5次，冷凍干燥，得到純化的動物軟骨；將動物軟骨采用低溫超微粉碎機粉碎，干燥器中保存待用； (2)未變性II型膠原的提取:將100?200份動物軟骨粉浸泡在1000?2000體積份含有4M鹽酸胍的0.05M Tris, IM NaCl，pH為7.5的Tris-NaCl緩沖溶液中，室溫下攪拌10?36h，接著10000?20000rpm離心10?30min，回收上清液，用去離子水反復(fù)清洗沉淀物，將沉淀物浸泡在PH2.0?2.5，3000?10000體積份的醋酸溶液，在恒溫4?10°C下緩慢攪拌3?10h，接著加入I?4份復(fù)合酶，4?10°C下轉(zhuǎn)動24?72h，得到酶溶動物軟骨II型膠原溶液； (3)未變性II型膠原的純化:向上述所得到的動物軟骨II型膠原溶液中加入最終濃度為0.9mol/L的氣化納粉末，4?10°C下攬摔10?16h，10000?20000rpm離心10?30min，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，用5?1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5?7.5，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，4?10°C下攪拌10?16h，接著10000?20000rpm離心10?30min，棄上層清液，將沉淀物再次溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，再用5?1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5?7.5，加入最終濃度為4mol/L的氯化鈉粉末，4?10°C下攪拌10?16h，再次以10000?20000rpm離心10?30min，取下層沉淀物，如此反復(fù)鹽析3?5次；將鹽析后得到的沉淀再溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，以濃度為0.1?0.5M的乙酸溶液為透析液透析處理2-3天，凍干，得到海綿狀未變性的動物軟骨II型膠原；所制得的動物軟骨II型膠原，其關(guān)鍵性能達到如下指標要求: 外觀:白色海綿狀，無肉眼可見之雜質(zhì)和變色； 色氨酸分析:應(yīng)不含有色氨酸； 重金屬含量:彡10 μ g/g(m/m)； 輕脯氨酸含量:應(yīng)不小于總蛋白含量的8.5%(m/m)； 脂質(zhì)體:彡l%(m/m)； 灰分:< 2% (m/m)； 雜蛋白含量:彡l%(m/m); 細胞毒性:細胞毒性反應(yīng)不大于I級； 無菌試驗:無菌； 致敏試驗:無遲發(fā)性超敏反應(yīng)； 皮內(nèi)反應(yīng)試驗:原發(fā)性刺激指數(shù)ΡΙΚ0.4。2.如權(quán)利要求1所述動物軟骨源的未變性II型膠原的制備方法，其特征在于所述的復(fù)合酶中含有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和葡聚糖酶，其三者的重量比為3:2:0.5。3.如權(quán)利要求1所述動物軟骨源的未變性II型膠原的制備方法，其特征在于所述的動物軟骨為新鮮、可溯源的，可以為豬、牛、雞、羊任意一種的軟骨。4.如權(quán)利要求1所述動物軟骨源的未變性II型膠原的制備方法，其特征在于所述的脫脂劑配方為:4.0 g /L多聚磷酸鈉，3.5 g /L EDTA, 18 g /L十二烷基苯磺酸鈉，10 g/L十一碳二元酸三乙醇胺，15 g /L平平加。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動物軟骨源的未變性II型膠原的制備方法，其特點是以新鮮可溯源的動物軟骨為原料，通過反復(fù)凍融、超聲脫脂、高滲液脫細胞、酸堿軟化等工藝對軟骨進行純化處理，再通過鹽酸胍除糖、浸酸、復(fù)合酶處理、多次鹽析、多次離心純化、膜透析、冷凍干燥等工藝，得到海綿狀未變性II型膠原。通過該方法得到的高純度、高產(chǎn)率的II型膠原，保留了膠原完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)，生物活性高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定易于保存，有利于軟骨細胞的黏附、生長、增殖，可用于醫(yī)用生物材料的制備。
【IPC分類】C07K1/30, C12P21/06
【公開號】CN105331662
【申請?zhí)枴緾N201510848452
【發(fā)明人】但年華, 劉新華, 但衛(wèi)華
【申請人】四川大學(xué)
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月30日