一種丹參內生真菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術領域，具體地說，是一種丹參內生真菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 丹酚酸是中藥丹參的一類水溶性成分。丹酚酸C是其中的一種，主要有抗氧化， 抗腫瘤和明顯的抗血小板聚集的作用。丹酚酸C主要來源于唇形科鼠尾草屬植物丹參 (SalviamiltiorrhizaBunge)的根。雖然丹參資源區(qū)域廣闊，且已進行大量的人工栽培； 但是其分布不集中，資源更新周期長，且人工栽培技術要求高，藥材質量參差各異。隨著丹 酚酸C眾多藥理活性的發(fā)現(xiàn)，其市場需求增大，通過直接采收丹參天然和人工資源將不能 滿足市場需求。另一方面，丹酚酸C化學合成困難，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。研究者們試圖通過生 物技術方法獲得丹酚酸C，因此，近年來這已成為人們關注的課題。
[0003] 中國專利文獻CN102676392A公開了一種丹參內生真菌及其應用，是從丹參植物 活體中采用內生真菌分離純化技術分離獲得的，經(jīng)微生物分類學鑒定為木霉Trichoderma atroviride，保藏號為CGMCCNo. 4712,通過其液體發(fā)酵，產(chǎn)生了丹參酮化合物丹參酮I和 丹參酮IIA。中國專利文獻CN104830717A公開了具有誘導丹酚酸B積累作用的丹參內 生真菌，為PseudomonaspsychrotoleransLG4,其保藏號為：CCTCCN0:M2015085,可促 進丹參毛狀根中酚酸類物質（丹酚酸B)含量的積累。中國專利文獻CN103992961A公 開了一株提高丹參產(chǎn)量及酚酸類成分含量的真菌，它是保藏編號為CGMCCNo. 6627的擬 青霉（Paecilomycessp.)，栽培丹參時在每株丹參幼苗根部分別施予固體培養(yǎng)的菌材 0. 5-1. 5g，經(jīng)與丹參幼苗共生栽培4-6月，能提高收獲期時丹參的產(chǎn)量和丹參總酚酸及丹 酚酸B的含量。
[0004] 關于一種能夠通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生丹酚酸C的丹參內生真菌及其應用目前還未 見報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生丹酚酸C的丹參內生真菌 及其應用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種丹參內生真菌，命名為球狀莖點霉D14(Phoma glomerata)〇
[0007] 所述的丹參內生真菌是從唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salviamiltiorrhiza Bunge)植物活體中采用內生真菌分離純化技術分離獲得的，經(jīng)微生物分類學鑒定為球狀莖 點霉D14(Phomaglomerata)。該菌株已保藏，保藏號為CGMCCNo. 11305,保藏日期2015年 09月09日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101。
[0008] 本發(fā)明所述的丹參內生真菌的固體培養(yǎng)特征為：
[0009] 在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)，生長緩慢，菌落圓形，平坦，最初 為白色，漸變?yōu)檫吘壈咨虚g灰褐色，絨狀，邊緣整齊，背面藍黑色。
[0010] 本發(fā)明所述的丹參內生真菌的液體培養(yǎng)特征為：
[0011] ⑴馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB，200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸餾水），搖瓶培養(yǎng)7 天，培養(yǎng)溫度28°C;
[0012] (2)發(fā)酵培養(yǎng)特征：
[0013] 培養(yǎng)第1天有少許l_2mm白色菌絲球出現(xiàn)，培養(yǎng)液澄清；培養(yǎng)第2天，菌絲球數(shù)量 變多，直徑增大至3-4mm，培養(yǎng)液澄清；培養(yǎng)第3天，菌絲球明顯增多，直徑增大至5-6mm;培 養(yǎng)第4天，菌絲球開始變黑，培養(yǎng)液也變黑；培養(yǎng)第5天，菌絲球已經(jīng)明顯全部變黑；培養(yǎng)第 6天和第7天，菌絲球與第5天沒有明顯差別。
[0014] 本發(fā)明所述的丹參內生真菌形態(tài)特征為：培養(yǎng)的菌絲體無色、沒有分枝，粗 1. 2-1. 6um，平滑，由沒有橫隔，多核的菌絲體構成。
[0015] 本發(fā)明所述的丹參內生真菌的ITS和5. 8SrDNA堿基序列如SEQIDNO. 1所示。 將測序結果于NCBI網(wǎng)站進行序列比對
[0016] (http://blast,ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。同球狀莖點霉Phomaglomerata AY183371相比同源性為100%。
[0017] 本發(fā)明的第二方面，提供上述丹參內生真菌在制備丹酚酸C中的應用。
[0018] 所述的丹酚酸C是采用所述的丹參內生真菌通過液體發(fā)酵制備得到。
[0019] 丹酚酸C，別名：丹參酚酸C，英文名：SalvianolicacidC，分子式：C26H2Q01Q，CAS: 115841-09-3,化學結構式如下：
[0020]
[0021] 本發(fā)明所述的丹參內生真菌，經(jīng)發(fā)酵可得丹酚酸類化合物丹酚酸C，其工藝步驟如 下：
[0022] 菌種活化一種子培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)一發(fā)酵產(chǎn)物甲醇勻漿一超聲提取一減壓濃縮 -HPLC和LC-HRMS/MS分析一丹酚酸類化合物。
[0023] 其中，發(fā)酵原料為馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB)，發(fā)酵方式為液體搖瓶培養(yǎng)；菌種活化 采用平板固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為PDA;種子培養(yǎng)為馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB);發(fā)酵培養(yǎng)基為 馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB)。培養(yǎng)時間：菌種平板培養(yǎng)活化72小時，種子液搖床培養(yǎng)72小 時，發(fā)酵培養(yǎng)7天。培養(yǎng)溫度：平板活化、種子搖床培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)均為28°C。搖床轉速： 種子搖床培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)均為180rpm。發(fā)酵物提?。喊l(fā)酵完畢，收集發(fā)酵產(chǎn)物，甲醇重懸 勻漿，超聲提取，減壓濃縮即得發(fā)酵物甲醇提取物，甲醇溶解殘留物采用HPLC、LC-MS/MS和 LC-HRMS/MS等分析方法分析得到丹酚酸C。
[0024] 本發(fā)明的第三方面，提供采用上述丹參內生真菌經(jīng)液體發(fā)酵制備丹酚酸C的方 法，包括以下步驟：
[0025] (A)取本發(fā)明的丹參內生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入 已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管，于28°C活化培養(yǎng)72小時；
[0026] (B)取活化培養(yǎng)后的菌種，在無菌條件下，轉接入已滅菌的液體PDB種子培養(yǎng)基 中，28°C下180rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子；
[0027] (C)配制好的PDB液體培養(yǎng)基，分裝入250ml的三角瓶中，每瓶約100ml，滅菌處 理，冷卻備用。無菌條件下，按照10%的接種量接種入種子，28°C下180rpm搖床培養(yǎng)7天；
[0028] (D)發(fā)酵完畢，收集培養(yǎng)物過濾后，將菌絲體懸于5倍體積的甲醇中勻漿5min，發(fā) 酵液旋至粘稠加甲醇，超聲處理60min;而后過濾減壓蒸干，甲醇復溶殘留物既得丹酚酸C。
[0029] 選用甲醇提取發(fā)酵產(chǎn)物是因為甲醇提取能力強，滲透性高，可更完全的提取菌絲 體中的成分。
[0030] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0031] 本發(fā)明所述的丹參內生真菌，通過菌株液體發(fā)酵能夠產(chǎn)生丹酚酸類化合物丹酚酸 C，是尋找丹酚酸C新資源的重要微生物，具有較大的應用價值。
[0032] 生物材料樣品的保藏信息：
[0033] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心