[0034] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0035] 保藏日期：2015年9月9日
[0036]保藏編號：CGMCCNO. 11305
[0037] 分類命名：球狀莖點霉D14(Phoma glomerata)
【附圖說明】
[0038]圖1.本發(fā)明所述丹參內(nèi)生真菌在PDA平板培養(yǎng)基上的形態(tài)圖。
[0039]圖2.本發(fā)明所述丹參內(nèi)生真菌在PDA液體培養(yǎng)基中的形態(tài)圖。
[0040] 圖3.本發(fā)明所述丹參內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物（b)和發(fā)酵液甲醇提取物（c) 中丹酚酸C與標準品（a)HPLC比對圖譜。
[0041] 圖4.本發(fā)明所述丹參內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物（e)和發(fā)酵液甲醇提取物（f) 中丹酚酸C與標準品（d)的LC-HRMS/MS比對圖譜。
【具體實施方式】
[0042] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0043] 實施例1
[0044] 本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌為從陜西商洛丹參葉中得到的菌株。
[0045] 本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌按以下步驟分離獲得：自來水沖洗30min去凈泥沙后，用 去離子水洗3次。將葉片按以下程序進行表面消毒：75%乙醇，30s- 1. 3M次氯酸鈉（3-5% 有效氯），lmin- 75%乙醇，30s-無菌去離子水洗3次。濾紙吸干殘留水份后，用滅過菌 的手術(shù)刀將葉片剪成lcmXlcm大小的組織塊，置于含有100mg/L青霉素的PDA(土豆200g/ L，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L)培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)。每天觀察樣品真菌生長的情況。5-7天 后有菌絲長出，挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，并按形態(tài)合并，一共分離 得到58株內(nèi)生真菌，其中，只有本發(fā)明的一株丹參內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生丹酚酸C。其分類命名 為球狀莖點霉D14(Phomaglomerata)，保藏編號為CGMCCNo.11305。
[0046] 實施例2
[0047] (1)取本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入 已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基平板，于28°C活化培養(yǎng)72小時；
[0048] (2)取活化培養(yǎng)后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體PDB種子培養(yǎng)基 中，28°C下180rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子；
[0049](3)配制好的PDB液體培養(yǎng)基，分裝入250ml的三角瓶中（每瓶約100ml)，滅菌處 理，冷卻備用。無菌條件下，按照10%的接種量接種入種子，28°C下180rpm搖床培養(yǎng)7天。
[0050] (4)發(fā)酵完畢，收集培養(yǎng)物過濾后，將菌絲體懸于5倍體積的甲醇中勻漿5min，發(fā) 酵液旋至粘稠加甲醇，超聲處理60min;而后過濾減壓蒸干，甲醇復溶殘留物即得丹酚酸C。
[0051] (5)HPLC色譜條件如下：色譜柱--Z0BAX-EXTEND-C18 反相柱（250mmX4. 6mm)， 流動相一一Η20(+0· 1%HC00H) (A)/ 乙腈（B)。梯度洗脫一一〔時間（min):B(乙腈）〕=〔 0.00:5% ) -( 10.00:5% ) -( 20.00:25% ) -( 30.00:25% ) -( 35.00:55% )- 〔40. 00:60%〕一〔 45. 00:90%〕，流速--lmL/min，進樣量--10uL，柱溫--25°C， 檢測波長--280nm。
[0052] (6)LC-HRMS/MS色譜條件如下：色譜柱--ColumnTechnology C18column(5um, 2·IX100mm);流動相--H20(+0· 1 %HC00H)-乙腈（+0· 1 %HC00H)，梯 度洗脫--〔時間（min) :B(乙腈+0· 1% 甲酸）〕=[0.00:5% ]-[1· 00:5% ]-[7· 00:95 % ] - [8· 00:95 % ]，流速--0· 4ml/min，進樣量--3μL。HRMS/MS參數(shù)--minrange- 100m/z，maxrange-1000m/z，scanrate-2Hz，gastemp-350°C,gasflow-11.0/min， Nebulizer-45psi〇
[0053] (7)經(jīng)以上HPLC和LC-HRMS/MS分析，如圖3和圖4所示，表明本發(fā)明的丹參內(nèi)生 真菌菌種液體發(fā)酵能夠產(chǎn)生丹酚酸C。
[0054] 以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實施例，熟悉本領域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種丹參內(nèi)生真菌，其特征在于，所述的丹參內(nèi)生真菌的分類命名為球狀莖點霉 D14(Phomaglomerata)，保藏編號為CGMCCNo.11305。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參內(nèi)生真菌在制備丹酚酸C中的應用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的丹酚酸C是采用所述的丹參內(nèi)生真 菌通過液體發(fā)酵制備得到。4. 一種制備丹酚酸C的方法，其特征在于，所述的丹酚酸C是采用如權(quán)利要求1所述的 丹參內(nèi)生真菌通過液體發(fā)酵制備得到。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備丹酚酸C的方法，其特征在于，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基是 馬鈴薯液體培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸餾水。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備丹酚酸C的方法，其特征在于，包括以下步驟： (A) 取所述的丹參內(nèi)生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌 的固體馬鈴薯培養(yǎng)基試管，于28°C活化培養(yǎng)72小時； (B) 取活化培養(yǎng)后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體馬鈴薯種子培養(yǎng)基中， 28°C下180rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子； (C) 配制好所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝入250ml的三角瓶中，每瓶約100ml，滅菌處 理，冷卻備用；無菌條件下，按照10%的接種量接種入種子，28°C下180rpm搖床培養(yǎng)7天； (D) 發(fā)酵完畢，收集培養(yǎng)物過濾后，將菌絲體懸于5倍體積的甲醇中勻漿5min，發(fā)酵液 旋至粘稠加甲醇，超聲處理60min;而后過濾減壓蒸干，甲醇復溶殘留物既得丹酚酸C。
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領域，具體是一種丹參內(nèi)生真菌，是從唇形科鼠尾草屬植物丹參植物活體中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離獲得的，分類命名為球狀莖點霉D14(Phoma？glomerata)，保藏編號為CGMCC？No.11305。本發(fā)明還通過丹參內(nèi)生真菌菌株液體發(fā)酵，產(chǎn)生了丹酚酸C。本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌是尋找丹酚酸C新資源的重要微生物，具有較大的應用價值。CGMCC NO. 1130520150909
【IPC分類】C12R1/645, C12P17/04, C12N1/14
【公開號】CN105349431
【申請?zhí)枴緾N201510740325
【發(fā)明人】鄭承劍, 秦路平, 李秀清, 韓婷, 張巧艷, 蔣益萍, 賈敏
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月4日