利用聯(lián)合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及利用聯(lián)合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前許多自主開發(fā)的新型農(nóng)用抗生素只是停留在實驗室階段，其中關(guān)鍵的原因就是生產(chǎn)菌的產(chǎn)素水平未達到工業(yè)化要求。所以，當(dāng)前擺在研究工作者面前一個主要的問題就是提高現(xiàn)有和正在開發(fā)的農(nóng)用抗生素生產(chǎn)菌的產(chǎn)素水平，加快農(nóng)用抗生素的產(chǎn)業(yè)化進程。常規(guī)的微生物誘變育種費時費力、隨機性高，通過基因工程手段已可實現(xiàn)單基因編碼的酶類的定向進化并進行超量表達，但對需要成簇基因編碼的抗生素等天然產(chǎn)物的產(chǎn)量提高則困難重重。研究表明聯(lián)合抗藥性突變篩選方法是一種新穎的優(yōu)化抗生素產(chǎn)生菌的新方法，聯(lián)合抗藥性突變可加強微生物合成抗生素的水平，并且這一優(yōu)化菌株的新方法能夠應(yīng)用于多種抗生素生產(chǎn)菌株的優(yōu)化并且能夠提高野生型菌株的抗生素產(chǎn)量。
[0003]豐加霉素能抑制多種病原真菌的生長，具有廣闊的生防應(yīng)用前景。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diasta tochromogenes)V>能合成豐加霉素，利用聯(lián)合抗藥性突變篩選方法改良淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌使其提高豐加霉素合成能力的研究未見有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明通過聯(lián)合抗藥性突變株的篩選，獲得對低濃度鏈霉素、高濃度鏈霉素和巴龍霉素都產(chǎn)生抗藥性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D的突變株，獲得的突變株產(chǎn)豐加霉素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯著提高。該發(fā)明為提高豐加霉素的產(chǎn)素水平提供了一種可靠的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是針對野生型菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D產(chǎn)豐加霉素水平低的不足，提供一種提高豐加霉素產(chǎn)素水平的方法；本發(fā)明的另一目的是提供了一株高產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D突變株。
[0006]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
利用聯(lián)合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產(chǎn)量的方法按以下步驟進行:
(I)低濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第一輪抗藥性突變株篩選)
淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Strep tomyces dias ta tochromogenes)，定名為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌Do該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號CGMCC N0.2060。前期研究表明用GYM固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，鏈霉素抑制淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D的MIC值為20 μ g/mL。
[0007]制備鏈霉素終濃度為100 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為100 μ g/mL。GYM固體培養(yǎng)基組分與濃度為葡萄糖4 g/L，Dried yeast extract 4g/L, Dried Malt extract-S 10 g/L, N-Z-Amine A I g/L，NaCl 2 g/L，OB 溶液 600 μ L,定容后用2 mol/L NaCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.3，瓊脂20 g/L ;其中OB溶液配置方法:稱取MgS04.7H20 25g，CuSO4.5H20 2.5g, FeSO4.7H20 3.75g, MnSO4.5H20 1.8g，CaCl2.2H2017.5g，ZnSO4.7H20 4.5g，加500 mL水，用前搖勻；用移液槍吸取1000 μ L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D孢子懸液(I X 16個/mL)于含有100 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，分別挑取單菌落至新的含有100 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為低濃度鏈霉素抗性突變株。
[0008](2)高濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第二輪抗藥性突變株篩選)
制備鏈霉素終濃度為2000 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為2000 μ g/mL。GYM固體培養(yǎng)基組分與濃度同步驟(I);用移液槍吸取1000 μ L低濃度鏈霉素抗性突變株(也即第一輪抗藥性篩選獲得的突變株)孢子懸液(I X 112個/mL)于含有2000 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-15天，分別挑取單菌落至新的含有2000 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7~10天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為高濃度鏈霉素抗性突變株。
[0009](3)巴龍霉素抗性突變株的獲得(第三輪抗藥性突變株篩選)
制備巴龍霉素終濃度為50 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中巴龍霉素濃度為50 μ g/mL。GYM固體培養(yǎng)基組分與濃度同步驟(I);用移液槍吸取1000 μ L第二輪篩選獲得的突變株孢子懸液(I X 112個/mL)于含有50 μ g/mL巴龍霉素的GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)10~15天，分別挑取單菌落至新的含有50μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7~10天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為巴龍霉素抗性突變株。
[0010](4)突變株發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黃豆粉40 g，NH4Cl 3 g，CaCO3 5 g, MgSO4 2 g，余量為水；每300 mL三角瓶裝60 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，配制后121 °C滅菌20 min，待冷卻至50 °C，無菌條件下分別挑取一鈾金環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D和抗藥性突變株孢子接種，28 °C±1 °C，發(fā)酵培養(yǎng)6天；發(fā)酵液經(jīng)5000 r/min離心10 min，上清液用于豐加霉素含量的測定。
[0011](5)豐加霉素的檢測
方法:采用SHIMADZU C18色譜柱(150 mmX4.6 mm, 5 μπι)，甲醇為流動相Α，水為流動相 B，梯度洗脫，洗脫程序為 0-15 min，5%-37% A ； 15-30 min，37%_100% A ;30_40 min,100%-5% A;流速 1.0 mL/min，檢測波長 279 nm，柱溫 30 °C。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
一是本發(fā)明通過聯(lián)合抗藥性突變株的篩選，獲得的突變株合成豐加霉素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯著提高，這為提高豐加霉素的產(chǎn)量提供了一種可靠的方法；
二是本發(fā)明提供了一