株高產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D突變株，為今后豐加霉素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明利用聯(lián)合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產(chǎn)量的方法做進一步描述。
[0014]實施例1:低濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第一輪抗藥性突變株篩選)
制備鏈霉素終濃度為100 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為100 μ g/mL。用移液槍吸取1000 μ L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D孢子懸液(I X 16個/mL)于GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，分別挑取單菌落至新的含有100 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為低濃度鏈霉素抗性突變株。共獲得低濃度鏈霉素抗性突變株8株，編號分別為fll，fl2，fl3，fl4，fl5，fl6，fl7和fl8，對這8株突變株按照技術(shù)方案中的步驟(4)進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)其中突變株Π1產(chǎn)豐加霉素能力較高，為483.58 mg/L，發(fā)酵水平是對照菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 D (151.12 mg/L)的 3.2 倍；
實施例2:高濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第二輪抗藥性突變株篩選)
制備鏈霉素終濃度為2000 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為2000 μ g/mL。用移液槍吸取1000 μ L低濃度鏈霉素抗性突變株fll孢子懸液(I X 112個/mL)于GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)10~15天，分別挑取單菌落至新的含有2000 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7~10天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為高濃度鏈霉素抗性突變株。共獲得高濃度鏈霉素抗性突變株3株，編號分別為s223，s225, s228，對這3株突變株按照技術(shù)方案中的步驟(4)進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)其中突變株s228產(chǎn)豐加霉素能力較高，為925.63 mg/L,發(fā)酵水平是對照菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D(153.01 mg/L)的 6.05 倍；
實施例3:巴龍霉素抗性突變株的獲得(第三輪抗藥性突變株篩選)
制備巴龍霉素終濃度為50 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中巴龍霉素濃度為50 μ g/mL。用移液槍吸取1000 μ L高濃度鏈霉素抗性突變株s228孢子懸液(I X 112個/mL)于GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)10~15天，分別挑取單菌落至新的含有50 μ g/mL巴龍霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7~10天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為巴龍霉素抗性突變株。共獲得巴龍霉素抗性突變株2株，編號分別為t3141和t3145 ；
實施例4:突變株液體發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黃豆粉40 g，NH4Cl 3g，CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，余量為水；每300 mL三角瓶裝60 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，配制后121 °C滅菌20 min，待冷卻至50 °C，無菌條件下分別挑取一鉑金環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D、突變株t3141和突變株t3145孢子接種，28 °C ± I °C，發(fā)酵培養(yǎng)6天；發(fā)酵液經(jīng)5000 r/min離心10 min，上清液用于豐加霉素含量的測定；
實施例5:豐加霉素的檢測方法:采用SHIMADZU C18色譜柱(150 mmX4.6 mm, 5 μπι)，甲醇為流動相Α，水為流動相 B，梯度洗脫，洗脫程序為 0-15 min，5%-37% A ； 15-30 min，37%_100% A ;30_40 min,100%-5% A;流速 1.0 mL/min，檢測波長 279 nm，柱溫 30 °C。
[0015]結(jié)果表明:淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株t3145和t3141發(fā)酵液中豐加霉素的含量分別為 2294.95 mg/L 和 1985.15 mg/L，與對照 150.39 mg/L 相比分別提高了 15.26 和 13.20倍，其中淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株t3145合成豐加霉素的能力最強，發(fā)酵效價達(dá)到2294.95mg/L ο
【主權(quán)項】
1.利用聯(lián)合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產(chǎn)量的方法，其特征在于通過聯(lián)合抗藥性突變株的篩選，獲得對低濃度鏈霉素100 μ g/mL、高濃度鏈霉素2000 μ g/mL和巴龍霉素.50 μ g/mL都產(chǎn)生抗藥性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) D的突變株，獲得的突變株產(chǎn)豐加霉素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯著提高，所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號CGMCC N0.2060。2.權(quán)利要求1所述的突變株合成豐加霉素的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000mL中含有可溶性淀粉20 g，黃豆粉40 g，NH4C1 3 g，CaC03 5 g，MgS04 2 g，余量為水，每.300 mL三角瓶裝60 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，配制后121°C滅菌20 min，待冷卻至50 °C，無菌條件下分別挑取一鉑金環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D和抗藥性突變株孢子接種，28°C 土 1°C，發(fā)酵培養(yǎng).6天，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，上清液用于豐加霉素含量的測定。
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用聯(lián)合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產(chǎn)量的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法通過聯(lián)合抗藥性突變株的篩選，獲得對低濃度鏈霉素、高濃度鏈霉素和巴龍霉素都產(chǎn)生抗藥性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（<i>Streptomyces？diastatochromogenes</i>）D的突變株，獲得的突變株產(chǎn)豐加霉素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯著提高。CGMCC No. 206020070525
【IPC分類】C12P19/40, C12N1/20, C12R1/525
【公開號】CN105349476
【申請?zhí)枴緾N201510966008
【發(fā)明人】申屠旭萍, 許益鵬, 俞曉平, 湯谷, 劉楠楠
【申請人】中國計量學(xué)院
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月22日