缺血性腦卒中miRNA標記物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及一種缺血性腦卒中miRNA標記物及其應用。
【背景技術】
[0002] 腦卒中是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞造成血液循環(huán)障礙而引起腦組織 損傷的一組疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，缺血性腦卒中是指局部腦組織包括 神經(jīng)細胞、腔質細胞和血管由于血液供應缺乏而發(fā)生的壞死。我國每年新發(fā)腦卒中病人約 150~200萬人，其中缺血性腦卒中占腦卒中病例的60~80%，頸內(nèi)動脈和椎動脈閉塞和 狹窄可引起缺血性腦卒中，年齡多在40歲以上，且男性較女性多，嚴重者可引起死亡。
[0003] miRNA是天然存在于體內(nèi)的21-22nt的非編碼RNA分子，是一類通過轉錄后基因沉 默對靶基因表達進行調節(jié)的RNA。據(jù)估計，生物體內(nèi)約有1/3的基因受miRNA的調控。miRNA 與RISC的復合體通過堿基配對可與靶基因mRNA5' -UTR或者3' -UTR中的互補序列相結 合，抑制蛋白質翻譯，或是引發(fā)mRNA降解，從而負調控靶基因的表達。
[0004] 檢測miRNA的表達水平可以為缺血性腦卒中的臨床診斷提供參考。而miRNA的異 常表達直接導致一些與疾病發(fā)生相關基因的表達異常，誘發(fā)疾病的發(fā)生。雖然已有報道證 明miRNA可以通過調控靶基因mRNA的表達，在缺血性腦卒中中起重要作用，但是其還沒有 應用到臨床上。目前，尚無快速簡便的實驗室血液檢測方法用于缺血性腦卒中的篩查和早 期檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于診斷缺血性腦卒中 的miRNA標記物。相比傳統(tǒng)的缺血性腦卒中的診斷方法，使用miRNA標記物來診斷缺血性 腦卒中具有及時性、靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風險，從而采取相應的預 防和治療措施。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：
[0007] 本發(fā)明提供了miRNA-4252在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的應用，所述 miRNA-4252 選自以下組中的至少一種：miRNA-4252 初始miRNA、miRNA-4252 前體miRNA、 成熟miRNA-4252 ;所述miRNA-4252初始miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切并表達成成熟 miRNA-4252 ;所述miRNA-4252前體miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切并表達成成熟miRNA-4252。
[0008] 進一步，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252,核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 進一步，診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括芯片或試劑盒；其中，所述芯片包括固相載 體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應于所 述miRNA-4252的部分或全部序列；所述試劑盒包括用于檢測所述miRNA-4252的表達水平 的試劑。
[0010] 應當知道，本發(fā)明的miRNA-4252包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其 顯示完整miRNA-4252核酸分子相同的功能，它們可能通過核苷酸殘基的缺失、置換或者插 入而突變。
[0011] 本領域人員熟知，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可以在miRNA的一端或者兩端增加保 護性堿基，如TT，也可對miRNA堿基進行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領域技術 人員熟知，在不影響miRNA-4252功能的條件下，對miRNA-4252進行堿基修飾或者在兩端增 加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體的實施方式中，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252。
[0013] 雖然在某些【具體實施方式】中所使用的是成熟miRNA-4252,但是本領域技術人員可 以預期，初始miRNA(pri-miRNA-4252)、前體miRNA(pre-miRNA-4252)將可以獲得與成熟 miRNA-4252同樣的技術效果，因為細胞有能力進一步將初始miRNA(pri-miRNA-4252)、前 體miRNA(pre-miRNA-4252)加工為成熟miRNA-4252〇
[0014] 本發(fā)明的miRNA-4252核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的 miRNA-4252主要呈單鏈形式，而miRNA-4252前體是部分自互補的，以形成雙鏈結構。本發(fā) 明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0015] 本發(fā)明提供了miRNA-4252在高通量測序平臺中的應用。通過高通量測序能獲知 待檢測樣本中miRNA-4252的表達水平，將待測樣本的結果同健康人的樣本相比，容易判斷 待測樣本是否患有缺血性腦卒中以及患缺血性腦卒中的風險。因此，通過高通量測序獲得 miRNA-4252表達水平與缺血性腦卒中相關性的應用同樣包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0016] 本發(fā)明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測miRNA-4252 的表達水平來診斷缺血性腦卒中。
[0017] 進一步，上面所述的產(chǎn)品包括芯片或試劑盒。其中，所述芯片包括固相載體；以及 固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應于上面所述 的miRNA-4252的部分或全部序列；所述試劑盒包括用于檢測上面所述的miRNA-4252的表 達水平的試劑。
[0018] 進一步，上面所述的寡核苷酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術中已經(jīng)報道的可用于診 斷缺血性腦卒中的miRNA的寡核苷酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同一芯片上通 過檢測多種miRNA指標聯(lián)合診斷缺血性腦卒中的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0019] 進一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因芯片領域的各種常用材料， 例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團（如醛基、氨基等）修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑 料片等。
[0020] 所述的miRNA芯片的制備可采用本領域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法，例如， 如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡 核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預定的序 列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨 基修飾，則其制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》； J.L.erisi?V.R.Iyer?P. 0.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolof geneexpressiononagenomicscale.Science，1997 ;278 :680和馬立人，蔣中華主編·生 物芯片.北京：化學工業(yè)出版社，2000,1-130。
[0021] 進一步，所述試劑盒包括SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系、用于擴增miRNA-4252 和內(nèi)參的引物對；所述SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0022] 進一步，所述擴增miRNA-4252的引物對序列如下：正向引物序列為 5' -GGCCACTGAGTCAGCACCA-3'，反向引物序列為 5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3' ；所述內(nèi)參為U6 snRNA，擴增內(nèi)參的引物對序列如下：正向引物序列為5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引 物序列為 5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
[0023] 進一步，所述試劑盒還包括M-MLV逆轉錄體系，所述M-MLV逆轉錄體系包括T重復 寡核苷酸01ig〇-dT、逆轉錄反應液、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
[0024] 進一步，可以將多種miRNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測 多種miRNA指標聯(lián)合診斷缺血性腦卒中的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0025] 本發(fā)明的miRNA-4252可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達 miRNA-4252的DNA片段的載體轉染細胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核表達載體。
[0026] 病毒載體可以是任何適當?shù)妮d體，包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關病毒載體、皰疹病毒（例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）載體、甲病毒載 體。
[0027] 真核表達載體可以是任何適當?shù)谋磉_載體，包括但不限于pCMV-Myc表達載體、 pcDNA3. 0表達載體、pcDNA3. 1表達載體、pEGFP表達載體、pEFBos表達載體、pTet表 達載體、PTRE表達載體、或者在公知表達載體的基礎上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0028] 可以表達miRNA-4252的DNA片段可以通過如下方式獲?。簭膍iRNA數(shù)據(jù)庫中 (http: //microrna.sanger.ac.uk/sequences/)尋找miRNA-4252 在基因組上的位置及 具體序列信息，根據(jù)基因組序列確定miRNA-4252初始miRNA的位置，在miRNA-4252初始 miRNA位置的上下游500-800bp區(qū)間內(nèi)設計特異性引物，擴增引物中間的序列即可獲得表 達miRNA-4252 的DNA片段。
[0029] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0030] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了miRNA-4252表達水平與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展相關，通過 檢測受試者miRNA-4252的表達水平，可以判斷受試者是否患有缺血性腦卒中或者判斷受 試者是否存在患有缺血性腦卒中的風險，從而指導臨床醫(yī)師給受試者提供預防方案或者治 療方案。
【附圖說明】
[0031] 圖1顯示利用QPCR檢測miRNA-4252在缺血性腦卒中患者血液中的表達情況。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。
[0033] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0034] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035] 實施例1與缺血性腦卒中相關的miRNA的篩選
[0036] 1、樣本獲?。焊魇占?0例健康人和缺血性腦卒中患者的血液樣本。上述所有標本 的取得均通過組織倫理委員會的同意。
[0037] 2、樣本總RNA的提取
[0038] 使用U-gene公司的Blood RNA提取試劑盒提取總RNA。具體步驟如下：
[0039] 1)每體積新鮮血液（最大1ml)加入5倍體積的1 XXR-I緩沖液，例如：每1ml血 液中加入5ml的XR-I緩沖液，漩渦振蕩混勻；
[0040] 2)冰浴15min，在漩渦振蕩器上迅速混勻兩次，溶液變清表明紅血細胞已裂解。如 果個別樣品的血細胞計容或ECR升高時，延長冰浴時間至20min;
[0041] 3)4°C下450g離心lOmin沉淀白細胞，完全棄去含有裂