解紅細(xì)胞的上清液；
[0042] 4)用2倍體積的XR-I緩沖液洗滌在步驟1中用到的每體積的全血，漩渦振蕩以完 全懸浮細(xì)胞；
[0043] 5)4°C下450g離心lOmin，并再次去掉上清；
[0044] 6)往成團(tuán)的白細(xì)胞中加入XR-II溶解緩沖液/2 -巰基乙醇，漩渦振蕩充分混勻。 500μ1以下的全血就加入400μ1XR-II溶解緩沖液，如果在步驟1中用到的是0. 5~ 1. 0ml的血液，則加650μ1XR-II溶解緩沖液。在加入XR-II溶解緩沖液之后，樣品應(yīng)保存 于一 70°C的條件下；
[0045] 7)加入等體積的70%乙醇，漩渦振蕩混勻；
[0046] 8)把所有的樣品（包括所有的沉淀）加到一個(gè)固定在一個(gè)2ml收集試管上的 Mu-Pu RNA分離柱上。10, 000g離心的15s，棄去流出液體；
[0047] 9)重復(fù)步驟7、8;
[0048] 10)用移液槍吸750 μ 1 RNA洗滌緩沖液I直接加到自旋柱上洗滌柱子。如上方法 離心并棄去2ml收集管；
[0049]11)把柱子裝到提供的一干凈的新2ml收集試管上，加入500 μ 1用乙醇稀釋的 RNA洗滌緩沖液II，離心，棄去流出液，重復(fù)使用該收集試管；
[0050]12)加入400 μ1 Wash solution，14000g離心2min ;
[0051] 13)再用500μ1的RNA洗滌緩沖液II洗滌柱子，離心并棄去流出液。然后用一個(gè) 空的收集試管，極速離心空柱子lmin以甩干Mu-Pu柱基質(zhì)；
[0052] 14)洗脫RNA。把柱子轉(zhuǎn)移到一干凈的1. 5ml離心管（試劑盒無提供）并用50~ 100μ1的DEPC-水（由試劑盒提供）洗脫RNA。確保加入的DEPC-水是直接加在柱基質(zhì)上， 極速離心lmin;
[0053] 15)加入 100μ1Enzyme Incubation Buffer和 15μ1DNase I，14000g離心 lmin；
[0054] 16)將收集管中的溶液重新移入柱，室溫放置15min;
[0055] 17)將收集到的RNA保存在_70°C冰箱中，待用。
[0056] 3、RNA樣品的質(zhì)量分析（NanoDroplOOO分光光度計(jì)）
[0057] NanoDroplOOO分光光度計(jì)檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求：0D260/0D280 為 1. 8-2. 2〇
[0058] 將上述提取的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量，在凝膠成像儀上觀測、拍照，保存圖像，一般認(rèn)為 28S: 18S彡2可以初步判定總RNA質(zhì)量較好。
[0059] 4、miRNA的提取和標(biāo)記
[0060] 1)用Ambion公司的miRNAs抽提試劑盒抽提獲得miRNA，具體操作按照相應(yīng)說明 書。樣品用T4RNA連接酶標(biāo)記步驟依照Thomson的方法。miRNA標(biāo)記方法大致如下：1. 4μg miRNA和 500ng5' -磷酸鹽-胞啼啶-尿啼啶cy3_3'（Dharmacon，Chicago，USA)及 2 單 位T4RNAligase(NEB，Ipswich，USA)，于4°C孵育2小時(shí)。每份miRNA樣品均設(shè)等量的相 應(yīng)陰性對照。
[0061] 2)標(biāo)記的RNA用0. 3M醋酸鈉和2. 5倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀，再用15μ1 含3XSSC、0. 2%SDS和15%甲酰胺的雜交液重懸，所有的雜交重復(fù)兩次，雜交用 LifterSlipTM(Erie，PAUSA)以保證雜交液在芯片和蓋片之間均勻流動(dòng)。
[0062] 3)將雜交室放在雜交儀BioMixerTMII上（CapitalBioCorp，Beijing，China)于 42 °C水浴過夜，用洗液洗兩遍。
[0063] 5、miRNA芯片操作：
[0064] miRNA芯片，采用博奧生物有限公司的miRNA表達(dá)譜芯片（單通道芯片），按照說 明書的指示進(jìn)行miRNA表達(dá)譜的檢測。
[0065] 6、結(jié)果：
[0066] 分析miRNA芯片表達(dá)譜的檢測結(jié)果，可知miRNA-4252在缺血性腦卒中患者血液和 健康人的血液中的表達(dá)存在顯著差異，與健康人的血液相比，在缺血性腦卒中患者血液中 的miRNA-4252的水平顯著升高。
[0067] 實(shí)施例2QPCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA-4252
[0068] 1、根據(jù)miRNA芯片的檢測結(jié)果選擇miRNA-4252進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施 例1中的樣本收集方式選擇缺血性腦卒中患者血液樣本和健康人血液樣本各80例。
[0069] 2、RNA提取過程同實(shí)施例1。
[0070] 3、逆轉(zhuǎn)錄：
[0071] 1)將 10pg-lμg的總RNA模板與 2μ1 10X緩沖液、2μ1dATP(lOmM)、0· 5μ1 polyA多聚酶、0. 5μ1核糖核酸酶（RNase)抑制劑和無核糖核酸酶水（RNasefreewater) 混合，體積最后為20μ1，37°C孵育lh。
[0072] 2)反應(yīng)管中加入ΙμL0.5yg/ylOligo(dT)特異性RT引物，70°C孵育 5min。
[0073] 3)立即冰上孵育至少2min，打斷RNA和引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0074] 4)將上述 20μ1 反應(yīng)混合物與 4μ1 5X緩沖液、1μ1dNTP(10mM)，0· 5μ1M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，〇. 5μ1核糖核酸酶（RNase)抑制劑，10μ1polyA反應(yīng)混合液和4μ1無核糖核 酸酶水（RNasefreewater)混合，42°C孵育lh〇
[0075] 4、QPCR反應(yīng)：
[0076] 1)引物設(shè)計(jì)
[0077] 擴(kuò)增miRNA-4252 的引物
[0078] 正向引物：GGCCACTGAGTCAGCACCA(SEQIDN0. 2)
[0079] 反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQIDΝ0· 3)
[0080] 擴(kuò)增U6snRNA的引物
[0081] 正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQIDΝ0· 4)
[0082] 反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQIDNO. 5)
[0083] 2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0084] 其中，SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購自Invitrogen公司。
[0085] 表1PCR反應(yīng)體系
[0086]
[0087] 3)PCR反應(yīng)條件：95°ClOmin，（95°C15s，60°C60s)X45 個(gè)循環(huán)。以SYBRGreen 作為熒光標(biāo)記物，在LightCycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，以U6snRNA作為參照 基因，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，AACT法進(jìn)行相對定量。
[0088] 5、結(jié)果
[0089] 如圖1所示，與健康人的血液相比，缺血性腦卒中患者血液中的miRNA-4252的表 達(dá)水平顯著升高，與miRNA芯片結(jié)果一致。
[0090] 上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. miRNA-4252在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述 miRNA-4252 選自以下組中的至少一種：miRNA-4252 初始miRNA、miRNA-4252 前體miRNA、 成熟miRNA-4252 ;所述miRNA-4252初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟 miRNA-4252 ;所述miRNA-4252前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA-4252。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括芯片 或試劑盒；其中，所述芯片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述 寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于權(quán)利要求1所述的miRNA-4252的部分或全部序列；所述 試劑盒包括用于檢測權(quán)利要求1所述的miRNA-4252的表達(dá)水平的試劑。4. 權(quán)利要求1所述的miRNA-4252在高通量測序平臺(tái)中的應(yīng)用，其特征在于，通過高通 量檢測miRNA-4252的表達(dá)水平，分析獲知所述miRNA-4252的表達(dá)異常與缺血性腦卒中的 發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。5. -種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠通過檢測miRNA-4252的 表達(dá)水平來診斷缺血性腦卒中。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片或試劑盒。其中，所述 芯片包括固相載體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括 特異性地對應(yīng)于權(quán)利要求1所述的miRNA-4252的部分或全部序列；所述試劑盒包括用于檢 測權(quán)利要求1所述的miRNA-4252的表達(dá)水平的試劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑盒包括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)體系、用于擴(kuò)增miRNA-4252和內(nèi)參的引物對；所述SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包 含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBRGreen熒光染料。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述擴(kuò)增miRNA-4252的引物對序列如下： 正向引物序列為 5' -GGCCACTGAGTCAGCACCA-3'，反向引物序列為 5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述內(nèi)參為U6snRNA，擴(kuò)增內(nèi)參 的引物對序列如下：正向引物序列為5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列為 5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑盒還包括M-MLV逆轉(zhuǎn) 錄體系，所述M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系包括T重復(fù)寡核苷酸Oligo-dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn) 錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種miRNA標(biāo)記物，該miRNA標(biāo)記物是miRNA-4252。通過檢測miRNA-4252的表達(dá)水平可用于診斷患者是否患有缺血性腦卒中。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，miRNA-4252可有效區(qū)分缺血性腦卒中患者和健康人。在此基礎(chǔ)上，miRNA-4252可以用于制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品。本發(fā)明大大能提高了缺血性腦卒中診斷的敏感性和特異性，實(shí)現(xiàn)缺血性腦卒中的早期診斷。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105349666
【申請?zhí)枴緾N201510853891
【發(fā)明人】楊承剛, 孫耀蘭
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月30日