檢測口蹄疫病毒和/或豬水泡病病毒的基因芯片以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測口蹄疫病毒和/或豬水泡病病毒的基因芯片以及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD)、豬水泡?。⊿winevesicular disease,SVD)分別是由口蹄疫病毒（Foot-andnouthdiseasevirus,FMDV)、豬水泡病病 毒（Swinevesiculardiseasevirus,SVDV)引起的哺乳動物的急性、高度接觸性傳染病， 其中，口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)有3種分型，具體是口蹄疫病毒 0型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaI型。口蹄疫病毒和豬水泡病病毒都可以感染豬， 發(fā)病率極高，并能夠形成大范圍的流行，能引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，均被世界動物衛(wèi)生組 織（0ΙΕ)列為法定報告動物疫病。這三種疾病均以豬舌、唇、口腔黏膜、乳頭和蹄冠等處上 皮發(fā)生水皰為主要癥狀，因此在臨床癥狀上無法對這三種疾病進行區(qū)分，必須通過病原學(xué) 進行鑒別診斷。
[0003]目前，對這三種疾病的診斷多采用分離鑒定及常規(guī)的血清學(xué)方法，所需時間較長， 也有PCR技術(shù)的鑒別方法，但還沒有建立操作性強且能同時鑒別三種病毒的方法。因此，有 必要建立能同時進行三種疫病快速檢測的方法，同時對口蹄疫病毒進行分型檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性強、靈敏度高、可同時檢測口蹄疫病 毒和豬水泡病病毒的基因芯片和試劑盒。
[0005] 基因芯片，是指指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、CDNA、gen〇miCDNA、多肽、 抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的 生物分子點陣，其突出的特點是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本發(fā)明檢測口蹄疫病毒和/或豬水泡病病毒的基因芯片，它包括固相載體以及固 定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQIDN0 :1~4所示任意一個或者任意多個基因 片段，用于分別檢測口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaI型和/或豬水泡 病病毒。
[0007] 其中，它還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQIDN0 :13~14所示。
[0008] 本發(fā)明檢測口蹄疫病毒和/或豬水泡病病毒的試劑盒，它包括前述基因芯片以及 擴增試劑；其中，擴增試劑包括SEQIDN0 :5~6、SEQIDN0 :7~8、SEQIDN0 :9~10和 /或SEQIDNO:11~12所示引物對，用于分別擴增口蹄疫病毒0型、口蹄疫病毒A型、口 蹄疫病毒AsiaI型，和/或豬水泡病病毒。
[0009] 其中，所述引物對中，上游引物與下游引物的摩爾比為1:1。
[0010] 其中，所述SEQIDN0 :5、7、9、11所示上游引物標(biāo)記有熒光染料。
[0011] 本發(fā)明還提供了SEQIDN0 :1~4所示任意一個或者任意多個基因片段在制備檢 測口蹄疫病毒0型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/或豬水泡病病毒的基因芯 片的用途。
[0012] 其中，所述還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO :13~14所示。
[0013]本發(fā)明還提供了SEQ ID NO :5~6、SEQ ID NO :7~8、SEQ ID NO :9~10和/或 SEQ ID N0 :11~12所示引物對以及SEQ ID N0 :1~4所示任意一個或者任意多個基因片 段所示基因片段在制備檢測口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/ 或豬水泡病病毒的試劑盒中的用途；其中，引物對為擴增試劑，SEQ ID N0 :1~4所示基因 片段為檢測探針。
[0014] 本發(fā)明基因芯片和試劑盒可以同時檢測口蹄疫病毒和豬水泡病病毒，而且能對口 蹄疫病毒進行分型檢測，特異性強，靈敏度高耗時短，檢測快速，可以迅速掌握畜禽疫病的 感染情況臨床應(yīng)用前景良好。
[0015] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0016] 圖1芯片矩陣設(shè)計
[0017] 圖2水化溫度優(yōu)化
[0018]圖3封閉液配比優(yōu)化。1: 0· 5 % BH4Na, 25 % Ethanol ;2: 0· 25 % BH4Na, 25 % Ethanol；
[0019] 3:0% BH4Na, 25% Ethanol；4:0. 5% BH4Na, 15% Ethanol；5:0. 25% BH4Na, 15% Ethanol ；:0 % BH4Na, 15% Ethanol；7:0.5 % BH4Na, 0%Ethanol；8:0. 25 % BH4Na, 0 % Ethanol；9:0% BH4Na,0%Ethanol.
[0020] 圖4探針篩選矩陣設(shè)計
[0021] 圖5 口蹄疫0型探針篩選
[0022] 圖6 口蹄疫Asia I型探針篩選
[0023] 圖7 口蹄疫A型探針篩選
[0024] 圖8豬水泡病探針篩選
[0025]圖9口蹄疫0型芯片靈敏度。A: 10-3 ;B: 10-4 ;C: 10-5 ;D: 10-6.
[0026]圖10口蹄疫A型芯片靈敏度。A: 10-5 ;B: 10-6 ;C: 10-7 ;D: 10-8.
[0027]圖11 口蹄疫Asia I型芯片靈敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0028]圖12 豬水泡病芯片靈敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0029]圖13口蹄疫0型引物的特異性實驗。1 :FMDV-0 ;2:FMDV-A ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10Negative control
[0030]圖14口蹄疫A型引物的特異性實驗。1:FMDV-A ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10Negative control
[0031]圖15口蹄疫Asia I型引物的特異性實驗。：FMDV-Asia I ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ; 4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10Negative control
[0032]圖16豬水泡病引物的特異性實驗。1:SVDV ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ;4:FMDV-Asia I ; 5:VSV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV； 10Negativecontrol
[0033] 圖17 口蹄疫0型不同廠家芯片檢測比對。A:上海百傲科技有限公司IMO,醛基基 片；B:北京博奧生物有限公司晶芯f醛基基片
[0034] 圖18 口蹄疫A型不同廠家芯片檢測比對。A:上海百傲科技有限公司BaiO醛基基 片；B:北京博奧生物有限公司晶芯^醛基基片
[0035] 圖19 口蹄疫AsiaI型不同廠家芯片檢測比對。Α:上海百傲科技有限公司BaiOM 醛基基片；B:北京博奧生物有限公司晶芯s'醛基基片
[0036] 圖20豬水泡病不同廠家芯片檢測比對。A:上海百傲科技有限公司BaiOl醛基基 片；B:北京博奧生物有限公司晶芯醛基基片
【具體實施方式】
[0037] 一、實驗材料和儀器
[0038] 1. 1材料試劑：
[0039]
[0040] 1· 2主要儀器
[0041 ]
[0042] 1.3實驗試劑的配制
[0043]引物稀釋：根據(jù)合成單，將合成的引物干粉加入適量滅菌超純水，制成100μΜ的 引物貯存液，使用時按照1 :4(引物貯存液：滅菌超純水）的體積比將其稀釋成20μΜ的引 物使用液；
[0044] 10g/L瓊脂糖凝膠：稱取lg瓊脂糖凝膠，加入lOOmLlXΤΑΕ電泳緩沖液中，微波爐 加熱3min，溶解完全后加入10mg/mL的EB5μL，震蕩混勾，倒入膠槽內(nèi)，待凝固后點樣；
[0045] 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：按照產(chǎn)品說明書，稱取所需質(zhì)量的培養(yǎng)基干粉于三角錐瓶內(nèi)，加 入相應(yīng)比例的去離子水，121°C滅菌20min，備用；
[0046] 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按照產(chǎn)品說明書，稱取所需質(zhì)量的培養(yǎng)基干粉于三角錐瓶內(nèi)，加 入相應(yīng)比例的去離子水，121 °C滅菌20min，備用。
[0047] 20XSSC:稱取NaCl，175. 2g，檸檬酸三鈉·2Η20，100· 5g，溶解于少量mini-Q超純 水中，用5MHC1調(diào)pH至7. 0,最后用Mini-Q雙蒸水定容到1L;
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