0XPBS:按mol數(shù)/1L含 1370mMNaCl，270mMKC1，lOlmMNa2HP04,18mMKH2P04 ; 按g數(shù) /1L含NaCl，80g，KC1，2g，Na2HP04 · 12H20, 35. 8g，KH2P04, 2. 7g，溶于 800mL蒸餾水 中，用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4,加蒸餾水定容至1L;
[0049] 10%SDS:稱取SDS100g，溶于 900mLMini-Q水中。
[0050] 雜交后洗液I:SSC終濃度為2X，SDS終濃度為0. 2%，若10%SDS產(chǎn)生白色絮狀 沉淀，請(qǐng)置于42°C水浴中溶解混勻后配制洗液。
[0051] 雜交后洗液II:SSC終濃度為(λ2X。
[0052] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測(cè)方法
[0053] 1、材料和儀器
[0054] 同前述實(shí)驗(yàn)材料和儀器。
[0055] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0056] 2. 1PCR引物、檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)與合成
[0057] 2.1.1引物設(shè)計(jì)：
[0058] 根據(jù)NCBI公布的FMDV-0型序列，F(xiàn)MDV-A型序列，F(xiàn)MDV-Asia1型序列，以及SVDV 序列，在充分比較同源性的基礎(chǔ)上，選取保守區(qū)用軟件PrimerPrimer5. 0軟件設(shè)計(jì)引物并 進(jìn)行BLAST序列比對(duì)初步驗(yàn)證引物特異性。本研究所用引物詳見表1，每對(duì)引物的上游引 的5'端均連接有一個(gè)Cy3熒光基團(tuán)。所有引物由生工生物工程（上海）公司合成。
[0059] 表1引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小
[0060]
[0061] 2. 1.2探針設(shè)計(jì)：
[0062] 根據(jù)2. 1. 1所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增區(qū)段，使用PrimerPrimer5.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)FMDV-0 型，F(xiàn)MDV-A型，F(xiàn)MDV-Asia1型以及SVDV的特異性探針，每種目的片段設(shè)計(jì)多條探針，以備 篩選。芯片探針序列及修飾方法：每條探針的5'端均通過15個(gè)胸腺嘧啶核苷酸連接有一個(gè) 氨基。前者的作用是使探針在固相支持物一一玻璃片上充分伸展開，后者的作用是與醛基 修飾的玻璃片進(jìn)行縮合反應(yīng)，以固定在玻片上。使用一段隨機(jī)序列作為位置質(zhì)控（Position control，PC)，其5'端連接有一個(gè)氨基，3'端連接一個(gè)Cy3熒光基團(tuán)；使用一段隨機(jī)序列作 為雜交質(zhì)控（Hybridcontrol,HC)其5'端連接有一個(gè)Cy3焚光基團(tuán)，并使用它的互補(bǔ)序列 作為雜交質(zhì)控探針（Hybridcontrol-probe,HC-p)其5'端同樣通過15個(gè)胸腺啼啶核苷酸 連接有一個(gè)氣基。檢測(cè)探針序列具體如表2,質(zhì)控序列如表3。
[0063] 表2檢測(cè)探針序列
[0064]
[0065] 表3質(zhì)控序列
[0066]
[0067] PC(PositionControl位置質(zhì)控）、HC(Hybridcontrol雜交質(zhì)控）、HC_p(HC-p本 身不發(fā)光，只有當(dāng)HC與HC-p結(jié)合后該位點(diǎn)才會(huì)發(fā)光）（HC-p(Hybridcontrol-probe雜交 質(zhì)控探針）
[0068] 2. 2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0069] 病毒基因組RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0070] 按照寶生物（大連）有限公司的病毒RNA/DNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA模 板。
[0071] 病毒目的基因的克隆、測(cè)序分析
[0072] ①以反轉(zhuǎn)錄的病毒cDNA為模板，分別使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0073]PCR體系
[0074]
[0075] ②根據(jù)膠回收試劑盒說明書，膠回收FMDV-0/A/As ia I及SVDV擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物， 40 μL Elution Buffer溶解。
[0076] ③根據(jù)pMD 19-T載體連接試劑盒說明書，按照如下體系把膠回收的DNA片段連接 于pMD 19-T載體上。
[0077] 連接體系：
[0078]
[0079] ④將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dH5α感受態(tài)細(xì)胞中，1)冰上融化感受態(tài)細(xì)胞；2)加入連接 后的質(zhì)粒，冰上放置40min，42°C水浴90s，置于冰上，備用；3)加800μL無Amp的營養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)基，37°C搖床震蕩培養(yǎng)40min~60min;4)培養(yǎng)液在5000rpm離心3min，棄上清800μL， 混勾，取50μL涂含Amp(50μg/mL)的營養(yǎng)瓊脂平板，37°C恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。
[0080]⑤次日，挑取轉(zhuǎn)化的dH5a-pMD19T-FMDV-0&FMDV-A&FMDV-Asia I&SVDV單菌落，接 入含411^1(50以8/11^)的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中，37<€，170印1]1震蕩培養(yǎng)過夜。
[0081] ⑥次日，取3mL經(jīng)上述培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒，操作步驟見質(zhì)粒提取試劑盒說明書。 提取質(zhì)粒DNA用80 μLElution Buffer洗脫，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳條件：100V， 25min，上樣 3μL。
[0082] ⑦提取質(zhì)粒利用如前所述的體系、條件進(jìn)行鑒定，模板體積為1 yL，PCR產(chǎn)物進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件：l〇〇V，25min，上樣3 μ L。
[0083] ⑧將陽性質(zhì)粒交由寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分 析。
[0084] 2. 3芯片制備
[0085] 使用北京博奧點(diǎn)樣緩沖液配制點(diǎn)樣體系。分別將6μ1位置質(zhì)控（PC，50μ M)、雜交 質(zhì)控（HC，50μ Μ)、陰性質(zhì)控（NC，ddH20)、檢測(cè)探針（50μ Μ)與等量2X點(diǎn)樣緩沖液混合，按 設(shè)計(jì)方案加入386孔板內(nèi)。
[0086] 使用Personal Arrayer? 16微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)進(jìn)行點(diǎn)樣。打開電源，并在電腦 上打開晶芯Personal Arrayer 16操作軟件，待其自檢完畢后進(jìn)入設(shè)置界面。首先裝載點(diǎn) 樣針，隨后進(jìn)行位置校正。清洗位置、抽干位置、超聲位置、第一片玻片位置、點(diǎn)樣板A24孔 位置均需要進(jìn)行校正。對(duì)超聲清洗槽注入超純水至標(biāo)定位置，放入386孔板，放入待點(diǎn)醛 基基片和用于預(yù)點(diǎn)樣的玻片，控制點(diǎn)樣儀內(nèi)環(huán)境濕度為50%-60% (儀器自動(dòng)控制）。在操 作軟件中設(shè)置點(diǎn)樣參數(shù)，在玻片設(shè)置中0X: 11.3, 0Y: 11. 3,起始玻片1，點(diǎn)樣玻片數(shù)和預(yù)點(diǎn) 樣玻片數(shù)按實(shí)際放入數(shù)量設(shè)置；在點(diǎn)陣設(shè)置中針陣點(diǎn)距X向和Y向均為400μm，針陣點(diǎn)數(shù) 均為6,樣品重復(fù)點(diǎn)數(shù)為3,陣間間隔X向?yàn)?mm，Y向?yàn)?1. 1mm，陣數(shù)X向?yàn)?，Y向?yàn)?,陣 列重復(fù)選擇是，預(yù)點(diǎn)樣點(diǎn)數(shù)為20,預(yù)點(diǎn)樣間距為500μm;在樣品設(shè)置中按實(shí)際386孔板布局 設(shè)置，在樣品設(shè)置的高級(jí)選項(xiàng)中，點(diǎn)樣停留時(shí)間為〇. 〇2s，Z軸抬針高度為2mm，Z軸落針深度 為2mm，取樣時(shí)Z軸深度修正為0mm，取樣停留時(shí)間為1. 5s，最多點(diǎn)樣點(diǎn)數(shù)為40 ;在清洗設(shè)置 中清洗、超聲、抽干均為ls，重復(fù)12輪以上。按芯片點(diǎn)陣設(shè)計(jì)要求，每個(gè)點(diǎn)樣體系樣品重復(fù) 3個(gè)點(diǎn)（位置質(zhì)控重復(fù)6個(gè)點(diǎn)），點(diǎn)樣順序?yàn)镻C、HC、樣品1 (FMDV-0)、樣品2 (FMDV-A)、樣品 3(FMDV-AsiaI)、樣品4(SVDV)、NC、PC，形成6X6的點(diǎn)陣，每張芯片點(diǎn)4個(gè)點(diǎn)陣，每個(gè)點(diǎn)陣可 以檢測(cè)一份樣品，如圖1。
[0087] 芯片探針點(diǎn)完后，在點(diǎn)樣儀內(nèi)靜置10_30min，然后把點(diǎn)好探針的芯片置于暗濕盒 內(nèi)，37°C水化過夜或放置12h以上，使探針與基片充分結(jié)合。水化后進(jìn)行基因芯片的封閉， 封閉需避光進(jìn)行：將芯片放入清洗液（0.2% SDS)中l(wèi)OOrpm緩慢搖動(dòng)5min，取出放入超純 水中提拉20次，放入封閉液中l(wèi)OOrpm緩慢搖動(dòng)5min，取出放入超純水中提拉20次，最后 800rpm離心lOmin甩干，使用博奧Luxscan-IOK/A芯片掃描儀掃描觀察。Luxscan-IOK/A 芯片掃描儀參數(shù)設(shè)置：通道：綠光通道；熒光染料：Cy3 ;P〇Wer :95 ;PMT :600 ;分辨率：10。
[0088] 2. 3. 1水化溫度的優(yōu)化
[0089] 按前述方法點(diǎn)樣完成后，將芯片置于暗濕盒中，分別于56°C烘箱、37°C培養(yǎng)箱、室 溫（18~24°C)、4°C冰箱中水化過夜，使用清洗液和超純水清洗（不使用封閉液處理）后 進(jìn)行掃描，觀察結(jié)果。
[0090] 結(jié)果如圖2所示，37°C與室溫的環(huán)境溫度條件下水化的芯片沒有明顯區(qū)別，且兩 者均效果較好，位置質(zhì)控的熒光點(diǎn)亮度非常高；而在4°C的環(huán)境溫度條件下，探針的水化效 率明顯不高，與醛基基片結(jié)合不穩(wěn)固，在沒有進(jìn)行封閉處理僅僅使用清洗液和超純水清洗 的情況下，位置質(zhì)控?zé)晒恻c(diǎn)的亮度偏低，與背景熒光值較為接近，在56°C的環(huán)境溫度下水化 的芯片部分出現(xiàn)了如2A所示的現(xiàn)象，推測(cè)是由于剛放入高溫高濕的環(huán)境中時(shí)，較低溫度的 芯片表面凝結(jié)了小水珠，這些小水珠融合了點(diǎn)樣點(diǎn)后發(fā)生了滑動(dòng)，造成了點(diǎn)陣的混亂。因 此，水化溫度控制在18-37Γ之間比較好。
[0091] 2. 3. 2封閉液配比的優(yōu)化
[0092] 按前述實(shí)驗(yàn)方法水化完成后分別進(jìn)行封閉，封閉液的配制方法如下表。
[0093] 表4封閉液配比優(yōu)化
[0094]
[0095] 結(jié)果如圖3和表5所