真菌致病相關(guān)蛋白PcCAT1及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種真菌致病相關(guān)蛋白化CAT1及其編碼基 因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒疫霉病已經(jīng)成為全球瓜類和辣椒生產(chǎn)的最嚴重威脅之一，該病可W在寄主植 物的任何生長階段發(fā)病，很難控制。目前辣椒疫霉病的防治工作仍然是W傳統(tǒng)的化學藥劑 防治為主，但由此引起了重金屬超標、農(nóng)藥殘留的問題，加之抗病育種工作進展緩慢，運一 系列問題給人類健康、環(huán)境安全帶來了巨大威脅，嚴重影響作物產(chǎn)量。
[0003]引起辣椒疫霉病的病原菌為辣椒疫霉（Phyto地thoracapsici)，屬于霜霉目，腐 霉科，疫霉屬，它是一種卵菌植物病原體，能引起辣椒及其他多種經(jīng)濟作物發(fā)生枯萎、爛根 等病癥。辣椒疫霉寄主廣泛，其中最主要的寄主是辣椒、西瓜、哈密瓜、甜瓜、黃瓜、西葫蘆、 冬瓜、南瓜、西紅柿、黑胡椒和茄子。因為辣椒疫霉能在±壤中存活好幾年，并且能侵染50 多種植物，所W截止目前，還沒有抗辣椒疫霉病的品種，輪作也沒有效果。可見，利用先進的 分子生物學技術(shù)對辣椒疫霉重要致病蛋白及其致病機制進行深入的探索已經(jīng)成為了當下 研究的熱點及重點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控辣椒疫霉對植物的致病力。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種真菌致病相關(guān)蛋白。
[0006] 本發(fā)明所提供的真菌致病相關(guān)蛋白，命名為化CAT1，來源于辣椒疫霉 (Phyto地thoracapsici),為如下al)或曰2)或曰3)的蛋白質(zhì)：
[0007]al)氨基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)；
[0008]a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白 質(zhì)；
[0009] a3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加得到的與真菌致病相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0010] 其中，序列表中序列2由638個氨基酸殘基組成。為了使al)中的蛋白質(zhì)便于純 化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或簇基末端連接上如表1所示的標簽。
[0011] 表l、t不簽的序列
[0012]

[0014] 上述a3)中的化CATl，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述a3)中的化CAT1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0016] 上述曰3)中的化CAT1的編碼基因可通過將序列表序列1所示的DNA序列中缺失一 個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5' 端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0017] 編碼所述化CAT1的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 所述編碼所述化CAT1的核酸分子可為如下化1)或化2)或化3)或化4)所示的 DNA分子：
[0019] 化1)核巧酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；
[0020] 化2)編碼區(qū)如序列表序列1所示的DNA分子；
[0021] 化3)與化1)或化2)限定的核巧酸序列具有75%或75%w上同一性，且編碼所述 化CAT1的DNA分子；
[0022] 化4)在嚴格條件下與化1)或化2)限定的核巧酸序列雜交，且編碼所述化CAT1的 DNA分子。
[002引其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0024] 其中，序列表序列1由1917個核巧酸組成，序列表序列1的核巧酸編碼序列表序 列2所示的氨基酸序列。
[0025] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼化CAT1的核巧酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明 分離得到的化CAT1的核巧酸序列75%或者更高同一性的核巧酸，只要編碼化CAT1且與真 菌致病相關(guān)，均是衍生于本發(fā)明的核巧酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0026] 運里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核巧酸序列具有75%或更 高，或80%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同 一性可W用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性 可W用百分比（％)表示，其可W用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0027] 抑制所述編碼所述化CAT1的核酸分子表達的物質(zhì)的應(yīng)用也就屬于本發(fā)明的保護 范圍。所述應(yīng)用可為如下（cl)、（c2)、（c3)、（c4)、（c5)或（c6):
[002引 （cl)抑制真菌；
[0029] (c2)制備抑制真困的廣品；
[0030] (c3)培育致病力降低的真菌；
[0031] (c4)制備用于培育致病力降低的真菌的產(chǎn)品；
[0032] (c5)培育抗真菌病的植物；
[0033] (c6)制備用于培育抗真菌病的植物的產(chǎn)品。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因真菌的方法。
[0035] 本發(fā)明所提供的一種培育轉(zhuǎn)基因真菌的方法，包括如下步驟：抑制出發(fā)真菌基因 組中上述任一所述化CATl的編碼基因的表達，得到致病力降低的轉(zhuǎn)基因真菌。
[0036] 上述方法中，所述"抑制出發(fā)真菌基因組中上述任一所述化CAT1的編碼基因的表 達"的物質(zhì)為表達上述任一所述化CAT1的編碼基因的反義基因的物質(zhì)。
[0037] 上述方法中，所述"抑制出發(fā)真菌基因組中上述任一所述化CAT1的編碼基因的表 達"的物質(zhì)具體可為表達序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的編碼基因的反義基因的物質(zhì)。
[0038] 所述反義基因的序列與序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的編碼基因反向互補。
[0039] 所述"抑制出發(fā)真菌基因組中上述任一所述化CAT1的編碼基因的表達"的物質(zhì)更 具體可為表達所述反義基因的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒具體可為PHAM34-CAT1-R。
[0040] 上述任一所述"抑制出發(fā)真菌基因組中上述任一所述化CAT1的編碼基因的表達 的物質(zhì)"也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0041] 所述"抑制出發(fā)真菌基因組中上述任一所述化CAT1的編碼基因的表達的物質(zhì)"具 體可為表達所述反義基因的重組質(zhì)粒。所述反義基因的序列與序列表中序列2所示的蛋白 質(zhì)的編碼基因反向互補。所述重組質(zhì)粒具體可為PHAM34-CAT1-R。
[004引所述PHAM34-CAT1-R具體可為向載體PHAM34的Smal識別序列插入核巧酸序列是 序列表的序列1所示的DNA分子，如果序列表的序列1所示的DNA分子與地am34啟動子的 方向相反，即得到重組質(zhì)粒PHAM34-CAT1-R。
[0043] 含有所述編碼所述化CAT1的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因 細胞系也屬于本發(fā)明的保護化圍。
[0044] 所述表達盒可為表達盒A;所述表達盒A包括啟動子、編碼所述化CAT1的核酸分 子和終止子。所述啟動子可為地am34啟動子；所述終止子可為tham34終止子。
[0045] 所述重組載體可為將所述化CAT1的編碼基因（即序列表序列1所示的DNA分子） 通過含有所述化CAT1的編碼基因的表達盒插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體 具體可為向載體PHAM34的Smal識別序列插入核巧酸序列是序列表的序列1所示的DNA分 子，如果序列表的序列1所示的DNA分子與地am34啟動子的方向一致，得到化CAT1基因過 表達載體，即得到重組質(zhì)粒PHAM34-CAT1-F;如果序列表的序列1所示的DNA分子與地am34 啟動子的方向相反，得到化CAT1基因沉默載體，即得到重組質(zhì)粒PHAM34-CAT1-R。
[0046] 所述重組微生物可通過將所述重組載體導入出發(fā)微生物得到。
[0047] 所述出發(fā)微生物可為酵母、細菌、藻類或真菌。
[0048] 所述真菌具體可為辣椒疫霉菌株SD33。
[0049] 所述重組微生物具體可為化CAT1基因沉默轉(zhuǎn)化子。所述化CAT1基因沉默轉(zhuǎn)化子 通過將重組質(zhì)粒PHAM34-CAT1-R導入辣椒疫霉菌株SD33基因組中得到。
[0050] 所述重組微生物具體可為化CAT1基因過表達轉(zhuǎn)化子。所述化CAT1基因過表達轉(zhuǎn) 化子通過將重組質(zhì)粒PHAM34-CAT1-F導入辣椒疫霉菌株SD33基因組中得到。<